本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：休眠相關(guān)抗原　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前，全球有三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，我國是結(jié)核病(tuberculosis，TB)負擔(dān)大國。MTB成為人類主要病原體的一個重要原因是MTB在人體內(nèi)能夠形成潛伏感染而長期存在[12]。傳統(tǒng)的抗TB藥物只對TB活動期的MTB有效，而對潛伏感染狀態(tài)的MTB則不能發(fā)揮作用�？ń槊纾˙CG）是目前唯一預(yù)防TB的疫苗，但其對成年人TB保護力不佳，主要原因之一是BCG不能增強宿主對潛伏感染狀態(tài)MTB的免疫應(yīng)答。因此，研究能夠預(yù)防或治療潛伏感染期MTB的新型疫苗對于控制TB具有重要意義。 以往研究表明，MTB在潛伏感染期主要以MTB休眠菌狀態(tài)存在，并能夠特異性表達與其休眠相關(guān)的蛋白，這些蛋白由休眠調(diào)節(jié)子DosR(dormancy regulon)基因編碼，共48個。目前關(guān)于這些休眠相關(guān)蛋白的功能研究還較少，已知在這些蛋白中，Rv2031c和Rv2626c在MTB的潛伏感染中起到重要作用，它們在潛伏感染期大量表達，是潛伏感染的標(biāo)志，而其具體功能仍知之甚少。MTB休眠相關(guān)蛋白具有較強的免疫原性，其中8個蛋白的免疫原性最強，包括Rv2031c和Rv2626c，它們能和MTB持續(xù)感染者的T細胞發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，刺激T細胞增殖，釋放IFN-γ和IL-2。因此，近來研究也將這些MTB休眠相關(guān)蛋白作為TB新型疫苗研究的重要候選抗原。 恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一種速生非致病性分枝桿菌，由于其與MTB同源，可作為MTB蛋白功能研究的一個有利載體。用其表達MTB抗原，不僅蛋白表達量高，而且能高度保持MTB抗原的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。此外，MS同BCG一樣，具有較強的免疫原性，可作為新的活疫苗載體用于各類疾病疫苗的研究，包括TB。 本研究選擇MTB休眠相關(guān)抗原Rv2031c和Rv2626c作為靶蛋白，以MS作為表達載體，構(gòu)建能夠表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重組MS（recombinant Mycobacterium smegmatis，rMS）。通過對rMS的生物學(xué)特性，rMS與體外小鼠巨噬細胞的相互作用，以及rMS刺激小鼠的免疫應(yīng)答觀察，進一步探索MTB休眠相關(guān)蛋白Rv2031c和Rv2626c的功能，并評價表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的rMS作為TB新型疫苗的研究前景。 一、表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建與鑒定 采用PCR方法，從MTB H37Rv基因組DNA中擴增獲得MTB休眠相關(guān)抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段，大小分別為435bp和480bp。同時利用引物設(shè)計，在Rv2626c上游引物中引入48bp的疏水性linker，以保障Rv2031c-Rv2626c融合蛋白中單個蛋白構(gòu)象的正確折疊。將各基因PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體進行測序，結(jié)果與Genbank公布的基因序列完全一致。 利用限制性酶切方法在pMD18-T載體中構(gòu)建Rv2031c-Rv2626c融合基因，將Rv2031c-Rv2626c融合基因亞克隆入大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭分泌表達載體pDE22中，將重組質(zhì)粒電穿導(dǎo)入MS感受態(tài)，構(gòu)建篩選重組MS，命名為Rv2031c-Rv2626c-rMS（rMS）。rMS的PCR鑒定表明能夠特異性擴增獲得Rv2031c-Rv2626c融合基因片段。將rMS在42℃熱誘導(dǎo)表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，rMS能夠特異性表達目的蛋白，大小約為35kDa，與理論值相符。Western-blot結(jié)果表明，目的蛋白能與抗Rv2031c和抗Rv2626c的單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)，反應(yīng)條帶大小位置相一致。 7H10固體平板培養(yǎng)rMS，觀察rMS的菌落形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原菌株MS相比，rMS菌落形狀偏圓，顏色偏白。7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)rMS，繪制細菌生長曲線，結(jié)果表明，與MS相比，rMS生長速率無明顯變化。 二、rMS與小鼠巨噬細胞的相互作用 將rMS和MS在體外以10:1（細菌：細胞）的MOI感染小鼠巨噬細胞RAW264.7。感染3h后,無菌D-Hanks液洗滌細胞，清除胞外細菌后繼續(xù)培養(yǎng)，并將此時計為感染0h。在感染后12h，使用抗酸染色、掃描電鏡和透射電鏡對感染的巨噬細胞進行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rMS和MS均能在體外感染小鼠巨噬細胞。在感染巨噬細胞內(nèi)能觀察到抗酸染色陽性的細菌，掃描電鏡可觀察到巨噬細胞正以直接攝入或胞吞的方式吞噬分枝桿菌，透射電鏡可觀察到rMS和MS感染巨噬細胞后能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡和壞死。 計數(shù)巨噬細胞感染后24h的活細胞數(shù)。結(jié)果表明，rMS組活細胞數(shù)（3.9±0.01）低于MS組（4.7±0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），提示rMS細胞毒性強于MS。在感染巨噬細胞后3h、6h、12h、24h和27h，計數(shù)感染細胞內(nèi)活菌數(shù)CFU。結(jié)果表明，MS在巨噬細胞內(nèi)逐漸被吞噬消化，而rMS則在巨噬細胞內(nèi)可以繁殖，延長在巨噬細胞內(nèi)的存活時間，提示所構(gòu)建的Rv2031c-Rv2626c融合蛋白在MS中的表達，能夠發(fā)揮一定的MTB休眠相關(guān)蛋白的功能，增強MS在巨噬細胞內(nèi)的存活能力，延長存活時間。 流式細胞儀檢測感染巨噬細胞發(fā)生的凋亡率和壞死率。結(jié)果顯示，與空白組相比，rMS和MS均可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡和壞死，rMS組的細胞凋亡率（53.6%±3%）低于MS組（79.9%±3%）（P0.05）；rMS組細胞壞死率（22%±3%）高于MS組（12%±2%）（P0.05）。表明rMS誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡能力低于MS組，而誘導(dǎo)壞死能力高于MS組，但仍主要以誘導(dǎo)細胞凋亡為主。 ELISA檢測感染巨噬細胞分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α的水平和釋放NO的濃度。結(jié)果顯示，rMS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IFN-γ和IL-6的水平高于MS（P0.05），但分泌TNF-α和NO的水平低于MS（P0.05）。表明rMS和MS均能誘導(dǎo)活化巨噬細胞功能，但具體的活化機制存在差異。 三、rMS刺激小鼠的特異性免疫應(yīng)答研究 采用rMS和MS以107CFU/0.1mL，BCG0.2mg/0.1mL分別背部皮下免疫BALB/c小鼠，每組10只，同時將正常小鼠作為陰性對照組。免疫4周后，分離免疫小鼠血清，ELISA檢測其抗體水平和抗體亞類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rMS免疫小鼠的抗體中能夠檢測到針對Rv2031c和Rv2626c的特異性抗體，表明rMS免疫小鼠后能夠在體內(nèi)表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白，并且融合蛋白能夠發(fā)揮單個蛋白的免疫原性。rMS免疫小鼠血清抗體總體水平高于MS組和BCG組（P0.05）。抗體亞類含量測定結(jié)果表明，，rMS同MS和BCG一樣，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG1和IgG2a抗體，但主要以IgG1為主（P0.05）。 分離各組免疫小鼠脾淋巴細胞，WST法檢測脾淋巴細胞抗原特異性增殖指數(shù)（SI），結(jié)果顯示，Rv2031c和Rv2626c蛋白單個或聯(lián)合刺激均能使rMS組小鼠脾淋巴細胞發(fā)生增殖，但以蛋白聯(lián)合刺激時的SI最高（SI≥3），表明Rv2031c和Rv2626c的融合表達具有免疫協(xié)同增強作用。rMS組小鼠脾淋巴細胞抗原特異性SI高于MS組和BCG組（P0.05）。 流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞所占百分比，結(jié)果顯示，rMS、MS和BCG與空白對照組相比均能刺激小鼠CD4+T細胞和CD8+T細胞所占百分比的增加（P0.05）。rMS組小鼠的CD4+T細胞的所占百分比高于MS和BCG組（P0.05），而CD8+T細胞所占百分比與MS和BCG組無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 ELISA檢測脾淋巴細胞分泌Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2的水平。結(jié)果顯示，rMS組小鼠的IFN-γ、IL-2水平均高于MS組和BCG組（P0.05），而且Rv2031c和Rv2626c聯(lián)合刺激rMS免疫小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ、IL-2水平均高于各單個蛋白刺激所分泌的（P0.05），這一結(jié)果與脾淋巴細胞增殖實驗結(jié)果相一致，也再次表明Rv2031c和Rv2626c具有免疫協(xié)同增強作用。 終上所述，MS表達的MTB休眠相關(guān)蛋白Rv2031c-Rv2626c能夠發(fā)揮一定的Rv2031c和Rv2626c單個蛋白的功能。同時，表達Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的rMS與MS和BCG相比，能夠刺激機體產(chǎn)生較強的抗原特異性免疫應(yīng)答，這為以MTB休眠相關(guān)蛋白作為候選抗原和以MS作為載體研制TB新型疫苗奠定了一定的理論基礎(chǔ)，值得進一步深入研究。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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2 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌疫苗對小鼠細胞因子產(chǎn)生及Th1/Th2應(yīng)答的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年11期

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本文編號：1611815