本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點(diǎn)：表面蛋白　出處：《吉林大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前，結(jié)核病仍是致死率最高的疾病之一，全球幾乎1/3人口為潛在結(jié)核患者，該人群中10%有發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核的可能。MTB致病機(jī)理復(fù)雜，疫苗研制及診斷研究已成為研究的熱點(diǎn)。篩選候選疫苗及檢測(cè)抗原，有助于深入了解其致病機(jī)制。表面蛋白（分泌蛋白、跨膜蛋白等)介導(dǎo)細(xì)菌與宿主的相互作用，與宿主最初接觸過程中能破壞宿主組織，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在MTB致病過程中起重要作用，并影響宿主免疫防御。MTB表面蛋白具有靶向免疫細(xì)胞并在其內(nèi)部潛伏增殖能力，了解MTB表面蛋白和宿主細(xì)胞的相互作用有利于了解MTB的致病機(jī)制。 本文構(gòu)建MTB H37Rv全基因組表面蛋白噬菌體展示文庫，直接完成了表面蛋白篩選、鑒別、表達(dá)純化及功能分析過程，MTB H37Rv全基因組噬菌體展示文庫庫容量為105，經(jīng)過表面蛋白篩選后共得到840個(gè)陽性克隆。隨機(jī)挑選其中200個(gè)克隆測(cè)序分析，共得到47個(gè)包含信號(hào)肽序列的表面蛋白，因此預(yù)知840個(gè)陽性克隆將有188個(gè)表面蛋白，與目前軟件預(yù)測(cè)MTB所含表面蛋白總數(shù)（179個(gè)）相近，顯示出該展示系統(tǒng)的高效性。 利用MTB表面蛋白噬菌體展示文庫進(jìn)行差減篩選，得到6個(gè)能與結(jié)核患者血清特異性結(jié)合的表面蛋白（Ag85B, ESAT-6, MPT-64, LpqA, cpsA和PapA2)。這些抗原在MTB毒力菌株中具有高表達(dá)性，從而導(dǎo)致其對(duì)于結(jié)核患者血清和BCG免疫血清顯示出不同的反應(yīng)性。在活動(dòng)性結(jié)核和治療后痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰性結(jié)核患者之間cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白的血清學(xué)反應(yīng)敏感性分別從80.1%降到13.3%和從79.3%降到14.0%。揭示在抗結(jié)核治療后抗原特異性血清學(xué)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，為篩選感染早期和潛伏期重要抗原提供了有效方法。 利用生物信息軟件將篩選的6個(gè)MTB表面蛋白進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，并合成17個(gè)B細(xì)胞表位多肽，ELISA方法檢測(cè)17個(gè)表位多肽與結(jié)核患者血清以及BCG免疫血清免疫學(xué)反應(yīng)。結(jié)果顯示8條多肽對(duì)結(jié)核患者血清顯示特異性反應(yīng)。同時(shí)表位多肽A1、C3和P3對(duì)痰培養(yǎng)陽性血清反應(yīng)敏感性明顯高于對(duì)治療后痰培養(yǎng)陰性血清。利用ELISPOT和流式細(xì)胞檢測(cè)方法來評(píng)價(jià)在活動(dòng)性結(jié)核患者以及治療后痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰性結(jié)核患者之間cpsA, PapA2和PaPA2噬菌體融合蛋白和表位多肽A1、C3、P3抗原特異性IFN-γ反應(yīng)差別。結(jié)果顯示，接受治療后cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白和表位多肽C3和A1抗原特異性IFN-γ反應(yīng)性明顯降低。驗(yàn)證了從感染期到恢復(fù)期抗原特異性血清學(xué)和T細(xì)胞免疫反應(yīng)動(dòng)態(tài)變化過程。證明PapA2、CspA表面蛋白是結(jié)核感染期的毒力因子，為進(jìn)一步篩選結(jié)核疫苗候選抗原提供理論基礎(chǔ)。 將cpsA, PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合Ag85B+ESAT-6噬菌體融合蛋白構(gòu)建多價(jià)疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行分析。應(yīng)用多色流式細(xì)胞分析方法將不同免疫組的抗原特異性多功能T細(xì)胞亞群進(jìn)行評(píng)價(jià)歸類，從而評(píng)價(jià)出抗結(jié)核免疫有效的宿T細(xì)胞亞群組成。結(jié)果顯示，新聯(lián)合蛋白組誘導(dǎo)高質(zhì)量體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，明顯優(yōu)于單抗原免疫，，而表位多肽激發(fā)的免疫反應(yīng)相對(duì)較弱。cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合免疫組能激發(fā)Ag85B抗原特異性白細(xì)胞介素-2（IL-2）,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ-干擾素（IFN-γ）三種細(xì)胞因子、IL-2和TNF-α兩種細(xì)胞因子以及TNF-α單細(xì)胞因子的高表達(dá)，從而證明了cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白可引起記憶性免疫應(yīng)答。 本研究成功構(gòu)建MTB表面蛋白噬菌體展示文庫，并利用該文庫進(jìn)行差減篩選，從而篩選到6個(gè)能與結(jié)核患者血清特異性結(jié)合的表面蛋白，對(duì)篩選表面蛋白進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)并合成相應(yīng)表位多肽。利用ELISA和流式細(xì)胞檢測(cè)方法來評(píng)價(jià)在活動(dòng)性結(jié)核患者以及治療后痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰性結(jié)核患者之間噬菌體融合蛋白和表位多肽抗原特異性血清學(xué)反應(yīng)及IFN-γ反應(yīng)差別，揭示抗結(jié)核治療后抗原特異性血清學(xué)及IFN-γ反應(yīng)性變化趨勢(shì)，為篩選結(jié)核感染期相關(guān)毒力因子提供平臺(tái)，亦為篩選疫苗候選基因提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)將cpsA, PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合Ag85B+ESAT-6噬菌體融合蛋白構(gòu)建多價(jià)疫苗，從體液免疫反應(yīng)水平、細(xì)胞因子表達(dá)水平、多功能細(xì)胞因子表達(dá)數(shù)量、T細(xì)胞亞群比例等多個(gè)指標(biāo)對(duì)各組合疫苗所誘導(dǎo)免疫反應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，亦對(duì)抗結(jié)核免疫有效的宿主T細(xì)胞亞群組成進(jìn)行系統(tǒng)詮釋，為結(jié)核疫苗提供新的評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 支軼,吳玉章,萬瑛;生物信息學(xué)方法在CTL表位預(yù)測(cè)中的應(yīng)用[J];免疫學(xué)雜志;2005年02期

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本文編號(hào)：1609841