本文選題：SARS　切入點：核衣殼蛋白　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：SARS即嚴重急性呼吸綜合癥,自2002年底我國廣東報道首例患者以來,在不到半年時間內(nèi)已在全球范圍內(nèi)造成8000余人感染,700余人死亡,致死率約10%。臨床數(shù)據(jù)顯示,SARS冠狀病毒可以引起機體免疫系統(tǒng)過度激活,從而導致急性炎癥。嚴重的急性呼吸窘迫癥引起的呼吸衰竭是病人致病致死的主要原因。目前對SARS冠狀病毒研究的進展多集中于細胞受體、抗體和疫苗開發(fā)等方面,但并未找到SARS導致炎癥過激,尤其是嚴重肺部急性炎癥的主要原因。 本室前期工作通過酵母雙雜交篩選到可能和SARS-CoV N蛋白相互作用的MASP2蛋白。MASP2是補體系統(tǒng)凝集素途徑的主要絲氨酸蛋白酶,當MBL識別病原糖基并被激活后,MBL通過改變構(gòu)象使MASP2自激活。活化形式的MASP2先后水解C4、C2形成C3轉(zhuǎn)化酶,啟動補體活化,發(fā)揮殺傷靶細胞的作用。補體活化中產(chǎn)生的補體片段具有趨化和調(diào)理作用,激活免疫細胞,釋放炎癥因子,引起局部和全身炎癥。 本研究試圖通過研究SARS-CoV N蛋白和MASP2的相互作用,從分子水平解釋SARS對機體免疫系統(tǒng)、尤其是炎癥發(fā)生發(fā)展方面的影響,進而揭示部分SARS致病機理,為病毒防治和藥物研究提供理論依據(jù)。 SARS-CoV N蛋白可以被釋放至患者血清,是SARS病人患病早期的診斷指標之一。本研究首先通過免疫共沉淀證實SARS-CoV N蛋白和人MASP2在體外存在相互作用,且其相互作用依賴于Ca2+。免疫共沉淀實驗進一步證實,SARS-CoV N蛋白可以和人血清以及小鼠血清中的MASP2結(jié)合。之后我們構(gòu)建了相關(guān)蛋白的截短突變體,通過免疫沉淀確認了SARS-CoV N蛋白和MASP2結(jié)合的結(jié)構(gòu)域為SARS-CoV N蛋白的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和MASP2的CUB1-EGF-CUB2結(jié)構(gòu)域,后者與MASP2自激活密切相關(guān),由此推測SARS-CoV N蛋白可能影響MASP2的自激活過程。 為了在體外直接研究SARS-CoV N蛋白對MASP2功能的影響,本研究通過強陽離子交換和分子篩純化了SARS-CoV N蛋白,通過原核表達和包涵體復性獲得了MASP2蛋白,從人血漿中使用親和層析獲得了MBL蛋白。通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白和MASP2的相互作用促進了MASP2同源二聚體的形成,尤其在MBL和甘露聚糖共同參與的情況下,SARS-CoV N蛋白顯著促進MASP2的二聚化。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),使MBL結(jié)合于微孔板上,檢測與之結(jié)合的MASP2,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白促進了MASP2和MBL結(jié)合。利用體外生化體系,使純化的MASP2和SARS-CoV N或甘露聚糖活化的MBL在特定離子環(huán)境中反應,使用western blot檢測MASP2自激活產(chǎn)生的水解片段,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白促進了MBL依賴的MASP2自激活。將純化的補體C4加入MASP2激活體系,用western blot檢測C4水解片段,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白可以促進MASP2水解C4,在MBL和甘露聚糖存在時尤為明顯。之后使用C4b沉積法分析MBL-MASP2復合物的活性,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白可以加強血清來源的MBL-MASP2的活性。 為了證實SARS-CoV N蛋白在人血清中也能發(fā)揮上述生化反應中的作用,本研究使用體外人血清體系作為MBL、MASP2和補體的原料庫和反應場所,通過使用C1q-depleted血清排除經(jīng)典途徑,通過凝集素途徑和替代途徑對離子需求的不同來分離這兩個途徑,利用補體沉積實驗發(fā)現(xiàn)SARS-CoV N蛋白可以通過凝集素途徑促進補體成分C3活化和C5b-9生成,而且比正常的活化程度提高一倍以上。 為了進一步證實SARS-CoV N蛋白在加強炎癥方面的作用,本研究構(gòu)建了致炎小鼠模型。用腺病毒載體在動物體內(nèi)表達SARS-CoV N蛋白,檢測動物血清中N蛋白含量可以達到SARS患者的相當水平。通過補體成分沉積實驗確認LPS可以使補體C4、C3活化,補體抑制劑C1INH和抗MASP2抗體對其有抑制作用。因此LPS可以激活補體途徑,并以凝集素途徑為主。LPS可以誘導小鼠血清中的補體系統(tǒng)尤其是凝集素途徑活化,從而引起急性炎癥。通過尾靜脈給小鼠注射LPS,并對同一只動物連續(xù)割尾取血,發(fā)現(xiàn)動物血清中補體活化后下游產(chǎn)生的炎癥因子LTB4的含量在1~2小時內(nèi)明顯升高,并于3小時后開始回落,5小時后降至初始值以下,C1INH和水飛薊賓(silybin)對LTB4升高有抑制,且后者在連續(xù)用藥后效果顯著。在動物體內(nèi)提前表達SARS-CoV N蛋白并通過尾靜脈注射LPS激活動物補體系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)表達SARS-CoV N蛋白的動物,其血清中LTB4的含量較對照動物提高至少一倍,C1INH和水飛薊賓對此現(xiàn)象有抑制作用。將動物分組后分別注射表達SARS-CoV N蛋白的腺病毒和腺病毒,并用LPS誘導急性炎癥,定時觀察動物存活情況,發(fā)現(xiàn)表達SARS-CoV N蛋白的小鼠被LPS誘導急性炎癥后,14小時內(nèi)全部死亡,而注射空病毒的動物70%存活,水飛薊賓對動物有保護作用。肺部病理切片證實表達SARS-CoV N蛋白的小鼠在LPS誘導急性炎癥后發(fā)生了更嚴重的肺損傷,肺泡壁增厚,多形核白細胞計數(shù)顯示白細胞浸潤明顯加強,而單表達SARS-CoV N蛋白或單用LPS刺激都沒有如此嚴重的損傷,水飛薊賓對癥狀有緩解作用。 本研究發(fā)現(xiàn)了SARS冠狀病毒核衣殼蛋白可以和血清中的免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白相互作用并影響其功能,并從分子水平部分解釋了SARS引起過激炎癥反應、尤其是包括肺損傷在內(nèi)的全身炎癥的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和反應機制,為研究SARS致病機制及天然免疫系統(tǒng)與病毒的相互作用提供了依據(jù),對于SARS的防治藥物研究具有參考價值。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳政良;補體激活第三途徑——凝集素途徑[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1999年05期

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本文編號：1609645