本文選題：肝素酶　切入點(diǎn)：多抗原肽　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景和目的] 腫瘤生物治療是繼手術(shù)、放療及化療之后的第四種腫瘤治療方式。而以樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療是當(dāng)今腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)。DC是目前發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)大抗原提呈功能的免疫細(xì)胞,將腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-asscociated antigen, TAA)與DC相結(jié)合是腫瘤免疫治療的方式之一。目前所發(fā)現(xiàn)的TAA大多具有組織特異性,如AFP抗原只在肝癌中表達(dá),PSA抗原只在前列腺癌中表達(dá),以這些TAA為基礎(chǔ)進(jìn)行腫瘤免疫治療只能殺傷表達(dá)該抗原的腫瘤組織或細(xì)胞,其治療窗窄。因此,尋找可用于大多數(shù)腫瘤免疫治療的腫瘤共有抗原是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。 肝素酶是一種內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶,它通過降解基底膜(Basement Membrane,BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix ,ECM)中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG)促進(jìn)細(xì)胞的遷移。國內(nèi)外許多研究表明,肝素酶在絕大多數(shù)中晚期腫瘤中表達(dá),與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。抑制肝素酶的表達(dá)可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移,而將肝素酶轉(zhuǎn)染至肝素酶陰性的腫瘤細(xì)胞中可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。我們過去的研究表明,肝素酶全長cDNA負(fù)載的DC可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肝素酶特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotic T Lymphocyte,CTL),對肝素酶陽性且MHC相匹配的胃癌細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng),該研究不僅提示肝素酶可作為腫瘤共有抗原用于腫瘤的免疫治療,而且在肝素酶的全長氨基酸序列中一定存在能誘導(dǎo)產(chǎn)生肝素酶特異性的CTL表位(Epitopes)。為此,我們進(jìn)一步采用生物信息學(xué)及反向免疫學(xué)技術(shù),預(yù)測并鑒定了3條人肝素酶抗原表位和2條小鼠肝素酶抗原表位。結(jié)果表明,上述多肽表位在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生肝素酶特異性CTL反應(yīng),對肝素酶陽性且MHC相匹配的不同來源的各腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng);動物實(shí)驗(yàn)表明,小鼠肝素酶抗原表位對腫瘤荷瘤小鼠具有明顯的免疫治療和免疫保護(hù)作用。 與肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以體外合成,沒有病毒載體的參與,安體性明顯提高,因此具有更廣闊的應(yīng)用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,體內(nèi)可能不能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫效應(yīng),因此限制了其臨床應(yīng)用。為解決這一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽(Multiple antigen peptides, MAP)的設(shè)計(jì)策略,即采用分子量小且免疫原性弱的賴氨酸為核心基質(zhì),將若干條(一般為4條或8條)抗原表位單體耦聯(lián)在一起,形成樹枝樣結(jié)構(gòu)。這種MAP疫苗的設(shè)計(jì)原理不僅適用于B細(xì)胞表位,而且適用于T細(xì)胞表位。 基于以上分析,本研究擬在以往研究的基礎(chǔ)上,將成功鑒定出的3條人肝素酶CTL表位[277-285(KMLKSFLKA,Hpa277), 525-533(PAFSYSFFV,Hpa525)和405-413 (WLS LLFKKL, Hpa405)]和2條小鼠肝素酶CTL表位[519-526(FSYGFFVI, mHpa519)和398-405(LSLLFKKL,mHpa398)分別構(gòu)建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其體內(nèi)及體外的抗腫瘤活性,并與肝素酶CTL表位單體多肽疫苗誘導(dǎo)的CTL活性進(jìn)行對比,為肝素酶T細(xì)胞MAP疫苗抗腫瘤效應(yīng)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 [方法] 1、將三條人肝素酶CTL表位[ 277-285(KMLKSFLKA, Hpa277) , 525-533 (PAFSYSFFV,Hpa525)和405-413(WLSLLFKKL, Hpa405)]以及兩條小鼠肝素酶CTL表位[519-526(FSYGFFVI, mHpa519)和398-405(LSLLFKKL, mHpa398)]設(shè)計(jì)成MAP結(jié)構(gòu),采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法(SPSS)合成MAPs;采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度;采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)測目標(biāo)多肽分子量。陰性對照肽選用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位(NYKHCFEI)。 2、按文獻(xiàn)分離培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)來源的DCs。采用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài),并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)。然后以人肝素酶MAP肽、相應(yīng)單肽分別負(fù)載DC后,誘導(dǎo)產(chǎn)生肝素酶特異性CTL,制備效應(yīng)細(xì)胞。采用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測肝素酶特異性CTL對不同靶細(xì)胞[SW480結(jié)腸癌細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、U2OS骨肉瘤細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞(Hpa~-, HLA-A2.1~+)、轉(zhuǎn)染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、HepG2肝癌細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1-)、轉(zhuǎn)染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌細(xì)胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)]的免疫殺傷效應(yīng);采用同樣方法檢測上述效應(yīng)細(xì)胞對少量表達(dá)肝素酶的自體淋巴細(xì)胞和DC的免疫殺傷活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技術(shù)檢測上述效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放情況。 3、按文獻(xiàn)分離培養(yǎng)C57BL/6-Tg(HLA-A2.1~+)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(mDC),采用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài),采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)。將所選人肝素酶CTL表位MAP肽、相應(yīng)單肽負(fù)載mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,采用~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測肝素酶特異性CTL對上述的靶細(xì)胞以及自體淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的殺傷效應(yīng);采用ELISPOT檢測效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放。 4、按文獻(xiàn)方法分離培養(yǎng)獲得C57BL/6(H-2K~b)小鼠骨髓來源的成熟樹突狀細(xì)胞(mDC),光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)和流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相應(yīng)單肽分別負(fù)載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴細(xì)胞當(dāng)作效應(yīng)細(xì)胞,采用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)檢測肝素酶多肽誘導(dǎo)的特異性CTL對不同腫瘤細(xì)胞[EL-4淋巴瘤細(xì)胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、B16黑色素瘤細(xì)胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、Lewis肺癌細(xì)胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、P815肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞(mHpa~+,H-2K~b-)]以及自體淋巴細(xì)胞和mDC的免疫殺傷效應(yīng)。采用ELISPOT檢測上述效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放。 5、為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的免疫保護(hù),先將肝素酶多肽負(fù)載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再將B16黑色素瘤細(xì)胞接種到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天測一次腫瘤直徑,一月后處死,比較腫瘤大小。為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的免疫治療作用,先將B16黑色素瘤細(xì)胞接種到C57BL/6小鼠皮下,待腫瘤長至1mm左右時(shí),再用肝素酶多肽負(fù)載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后處死,比較腫瘤大小。為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的生存時(shí)間的影響,采用免疫治療的研究方法,觀察肝素酶疫苗接種后,記錄死亡小鼠的死亡時(shí)間、數(shù)量及組別,觀察時(shí)間為三個月。 6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),當(dāng)P㩳0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1、采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法(SPSS)合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相應(yīng)的單肽。采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度。采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)測其分子量。結(jié)果表明合成的多抗原肽及相應(yīng)單肽的純度均在90%以上,達(dá)到國際多肽實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。所得肽的分子量理論值與實(shí)測值之間無明顯差異,說明所合成的肽是我們所需的目的多肽。 2、體外(In vitro)和離體(Ex vivo)實(shí)驗(yàn)表明,人肝素酶特異性CTL對于肝素酶陽性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng),且肝素酶MAP肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)明顯高于相應(yīng)單肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng);但對HLA-A2.1陽性但肝素酶陰性的MCF-7細(xì)胞和肝素酶陽性但HLA-A2.1陰性的HepG2細(xì)胞均無殺傷效應(yīng),而對肝素酶陽性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa細(xì)胞和HepG2/HLA-A2.1細(xì)胞,且MAP肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)亦明顯高于相應(yīng)單肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。提示人肝素酶MAP肽能激發(fā)較相應(yīng)單肽更強(qiáng)的特異性抗腫瘤效應(yīng);肝素酶MAP肽誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)具有肝素酶特異性且受HLA-A2.1限制。進(jìn)一步檢測了肝素酶特異性CTL對少量表達(dá)肝素酶的自體淋巴細(xì)胞和DC是否具有免疫殺傷效應(yīng),結(jié)果表明無論是肝素酶MAP肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞,還是相應(yīng)單肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞,均對上述兩種靶細(xì)胞無明顯殺傷效應(yīng),提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT檢測效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌情況,結(jié)果表明MAP肽可以誘導(dǎo)更多的效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。在刪除CD4~+T淋巴細(xì)胞后,肝素酶MAP肽及相應(yīng)單肽誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4~+T淋巴細(xì)胞在CD8+ T淋巴細(xì)胞的生成過程中具有重要作用。 3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特異性CTL對肝素酶陽性且H-2K~b陽性的EL-4淋巴瘤細(xì)胞、Lewis肺癌細(xì)胞以及B16黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng),且小鼠肝素酶MAP肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)明顯高于相應(yīng)單肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng);而對肝素酶陽性但H-2K~b陰性的P815肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞不具有殺傷效應(yīng),對少量表達(dá)肝素酶的自體淋巴細(xì)胞和mDC亦不具有殺傷效應(yīng)。進(jìn)一步采用ELISPOT檢測肝素酶特異性效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌能力,結(jié)果顯示肝素酶MAP肽促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌能力明顯高于相應(yīng)的單肽;在刪除CD4~+T淋巴細(xì)胞后,上述效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ分泌水平均明顯下降。 4、在體研究小鼠肝素酶MAP肽及其相應(yīng)的單肽對小鼠的免疫保護(hù)及免疫治療效應(yīng)。免疫保護(hù)效應(yīng)結(jié)果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相應(yīng)的單肽免疫保護(hù)組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于陰性肽組及未保護(hù)組(PBS組)(p0.05),且MAP肽組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于相應(yīng)單肽組(p0.05),提示小鼠肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠免疫保護(hù)效應(yīng)高于相應(yīng)的單肽組。免疫治療效應(yīng)結(jié)果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相應(yīng)的單肽免疫治療組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于陰性肽組及未治療組(PBS組)(p0.05),且多抗原肽組小鼠皮下腫瘤體積小于相應(yīng)單肽組(p0.05),提示小鼠肝素酶多抗原肽對荷瘤小鼠免疫治療效應(yīng)強(qiáng)于相應(yīng)的單肽組。進(jìn)一步研究肝素酶多肽疫苗對荷瘤小鼠的生存時(shí)間的影響,結(jié)果表明,肝素酶MAP肽組荷瘤小鼠生存時(shí)間明顯長于陰性肽組及未治療組(PBS組),同樣長于相應(yīng)的單肽組。 [結(jié)論] 1、采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法(SPSS)合成三條人及兩條小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa(525-533)(PAFSYSFFV),MAP4-Hpa(277-285)(KMLKSFLKA), MAP4-Hpa(405-413)(WLSLLFKKL), MAP4-mHpa(398-405)(LSLLFKKL), MAP4-mHpa (519-526) (FSYGFFVI)]及相應(yīng)的單肽,采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度,采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)測其分子量。結(jié)果表明合成的多抗原肽及相應(yīng)單肽的純度達(dá)到國際多肽實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),所合成的肽的分子量理論值與實(shí)測值無明顯差異,為我們所需的目的多肽。 2、無論人還是小鼠的肝素酶MAP肽體外及離體均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較相應(yīng)單肽更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng),這種抗腫瘤免疫效應(yīng)是肝素酶特異、且受MHC限制。肝素酶特異性CTL,無論是MAP肽誘導(dǎo)的,還是相應(yīng)單肽誘導(dǎo)的,對少量表達(dá)肝素酶的自體淋巴細(xì)胞和DCs均無明顯的殺傷效應(yīng),提示這種疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌能力強(qiáng)于相應(yīng)的單肽,這種IFN-γ分泌能力在CD4~+T淋巴細(xì)胞刪除后明顯減少,提示肝素酶MAP可以通過促進(jìn)IFN-γ的分泌以增強(qiáng)非特異性的抗腫瘤效應(yīng),CD4~+T淋巴細(xì)胞在CD8+T淋巴細(xì)胞的生成過程中發(fā)揮重要作用。 3、體內(nèi)研究證實(shí)小鼠肝素酶MAP肽可以增強(qiáng)荷瘤鼠的免疫保護(hù)及免疫治療效應(yīng),并且可以明顯增加荷瘤鼠的生存率,延長荷瘤鼠的生存時(shí)間。 以上研究表明,肝素酶MAP肽不僅能激發(fā)較相應(yīng)單肽更強(qiáng)的特異性的抗腫瘤效應(yīng),而且還能誘導(dǎo)一個較相應(yīng)單肽更強(qiáng)的非特異性抗腫瘤的良性循環(huán),這種肝素酶MAP疫苗具有高效、特異、安全的特點(diǎn),為肝素酶MAP肽疫苗的臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1608842