本文選題：肝素酶　切入點：多抗原肽　出處：《第三軍醫(yī)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[背景和目的] 腫瘤生物治療是繼手術、放療及化療之后的第四種腫瘤治療方式。而以樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs)為基礎的腫瘤免疫治療是當今腫瘤生物治療研究的熱點。DC是目前發(fā)現的具有強大抗原提呈功能的免疫細胞,將腫瘤相關抗原(Tumor-asscociated antigen, TAA)與DC相結合是腫瘤免疫治療的方式之一。目前所發(fā)現的TAA大多具有組織特異性,如AFP抗原只在肝癌中表達,PSA抗原只在前列腺癌中表達,以這些TAA為基礎進行腫瘤免疫治療只能殺傷表達該抗原的腫瘤組織或細胞,其治療窗窄。因此,尋找可用于大多數腫瘤免疫治療的腫瘤共有抗原是腫瘤免疫治療的關鍵。 肝素酶是一種內源性糖苷內切酶,它通過降解基底膜(Basement Membrane,BM)和細胞外基質(Extracellular Matrix ,ECM)中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG)促進細胞的遷移。國內外許多研究表明,肝素酶在絕大多數中晚期腫瘤中表達,與腫瘤患者的預后密切相關。抑制肝素酶的表達可以抑制腫瘤的轉移,而將肝素酶轉染至肝素酶陰性的腫瘤細胞中可以促進腫瘤的轉移。我們過去的研究表明,肝素酶全長cDNA負載的DC可以誘導產生肝素酶特異性的細胞毒T淋巴細胞(Cytotic T Lymphocyte,CTL),對肝素酶陽性且MHC相匹配的胃癌細胞具有明顯的殺傷效應,該研究不僅提示肝素酶可作為腫瘤共有抗原用于腫瘤的免疫治療,而且在肝素酶的全長氨基酸序列中一定存在能誘導產生肝素酶特異性的CTL表位(Epitopes)。為此,我們進一步采用生物信息學及反向免疫學技術,預測并鑒定了3條人肝素酶抗原表位和2條小鼠肝素酶抗原表位。結果表明,上述多肽表位在體內外均可誘導機體產生肝素酶特異性CTL反應,對肝素酶陽性且MHC相匹配的不同來源的各腫瘤細胞具有明顯的殺傷效應;動物實驗表明,小鼠肝素酶抗原表位對腫瘤荷瘤小鼠具有明顯的免疫治療和免疫保護作用。 與肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以體外合成,沒有病毒載體的參與,安體性明顯提高,因此具有更廣闊的應用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,體內可能不能誘導足夠強的免疫效應,因此限制了其臨床應用。為解決這一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽(Multiple antigen peptides, MAP)的設計策略,即采用分子量小且免疫原性弱的賴氨酸為核心基質,將若干條(一般為4條或8條)抗原表位單體耦聯在一起,形成樹枝樣結構。這種MAP疫苗的設計原理不僅適用于B細胞表位,而且適用于T細胞表位。 基于以上分析,本研究擬在以往研究的基礎上,將成功鑒定出的3條人肝素酶CTL表位[277-285(KMLKSFLKA,Hpa277), 525-533(PAFSYSFFV,Hpa525)和405-413 (WLS LLFKKL, Hpa405)]和2條小鼠肝素酶CTL表位[519-526(FSYGFFVI, mHpa519)和398-405(LSLLFKKL,mHpa398)分別構建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其體內及體外的抗腫瘤活性,并與肝素酶CTL表位單體多肽疫苗誘導的CTL活性進行對比,為肝素酶T細胞MAP疫苗抗腫瘤效應的臨床應用提供理論依據。 [方法] 1、將三條人肝素酶CTL表位[ 277-285(KMLKSFLKA, Hpa277) , 525-533 (PAFSYSFFV,Hpa525)和405-413(WLSLLFKKL, Hpa405)]以及兩條小鼠肝素酶CTL表位[519-526(FSYGFFVI, mHpa519)和398-405(LSLLFKKL, mHpa398)]設計成MAP結構,采用標準固相肽合成法(SPSS)合成MAPs;采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度;采用液相色譜/質譜聯用(LC/MS)測目標多肽分子量。陰性對照肽選用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位(NYKHCFEI)。 2、按文獻分離培養(yǎng)人外周血單個核細胞(PBMC)來源的DCs。采用光學顯微鏡觀察其形態(tài),并采用流式細胞術鑒定其細胞表面CD分子的表達。然后以人肝素酶MAP肽、相應單肽分別負載DC后,誘導產生肝素酶特異性CTL,制備效應細胞。采用標準51Cr釋放實驗檢測肝素酶特異性CTL對不同靶細胞[SW480結腸癌細胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、KATO-Ⅲ胃癌細胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、U2OS骨肉瘤細胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、MCF-7乳腺癌細胞(Hpa~-, HLA-A2.1~+)、轉染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌細胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)、HepG2肝癌細胞(Hpa~+, HLA-A2.1-)、轉染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌細胞(Hpa~+, HLA-A2.1~+)]的免疫殺傷效應;采用同樣方法檢測上述效應細胞對少量表達肝素酶的自體淋巴細胞和DC的免疫殺傷活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技術檢測上述效應細胞IFN-γ釋放情況。 3、按文獻分離培養(yǎng)C57BL/6-Tg(HLA-A2.1~+)小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(mDC),采用光學顯微鏡觀察其形態(tài),采用流式細胞術鑒定細胞表面CD分子的表達。將所選人肝素酶CTL表位MAP肽、相應單肽負載mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴細胞作為效應細胞,采用~(51)Cr釋放實驗檢測肝素酶特異性CTL對上述的靶細胞以及自體淋巴細胞和樹突狀細胞的殺傷效應;采用ELISPOT檢測效應細胞IFN-γ釋放。 4、按文獻方法分離培養(yǎng)獲得C57BL/6(H-2K~b)小鼠骨髓來源的成熟樹突狀細胞(mDC),光學顯微鏡觀察其形態(tài)和流式細胞術檢測其細胞表面CD分子的表達。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相應單肽分別負載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴細胞當作效應細胞,采用標準51Cr釋放試驗檢測肝素酶多肽誘導的特異性CTL對不同腫瘤細胞[EL-4淋巴瘤細胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、B16黑色素瘤細胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、Lewis肺癌細胞(mHpa~+,H-2K~(b+))、P815肥大細胞瘤細胞(mHpa~+,H-2K~b-)]以及自體淋巴細胞和mDC的免疫殺傷效應。采用ELISPOT檢測上述效應細胞IFN-γ釋放。 5、為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的免疫保護,先將肝素酶多肽負載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再將B16黑色素瘤細胞接種到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天測一次腫瘤直徑,一月后處死,比較腫瘤大小。為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的免疫治療作用,先將B16黑色素瘤細胞接種到C57BL/6小鼠皮下,待腫瘤長至1mm左右時,再用肝素酶多肽負載的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后處死,比較腫瘤大小。為研究肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠的生存時間的影響,采用免疫治療的研究方法,觀察肝素酶疫苗接種后,記錄死亡小鼠的死亡時間、數量及組別,觀察時間為三個月。 6、實驗數據以x±SD表示,采用SPSS11.5統計軟件進行t檢驗,當P㩳0.05時認為有統計學意義。 [結果] 1、采用標準固相肽合成法(SPSS)合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相應的單肽。采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度。采用液相色譜/質譜聯用(LC/MS)測其分子量。結果表明合成的多抗原肽及相應單肽的純度均在90%以上,達到國際多肽實驗標準。所得肽的分子量理論值與實測值之間無明顯差異,說明所合成的肽是我們所需的目的多肽。 2、體外(In vitro)和離體(Ex vivo)實驗表明,人肝素酶特異性CTL對于肝素酶陽性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ細胞具有明顯的殺傷效應,且肝素酶MAP肽誘導的殺傷效應明顯高于相應單肽誘導的殺傷效應;但對HLA-A2.1陽性但肝素酶陰性的MCF-7細胞和肝素酶陽性但HLA-A2.1陰性的HepG2細胞均無殺傷效應,而對肝素酶陽性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa細胞和HepG2/HLA-A2.1細胞,且MAP肽誘導的殺傷效應亦明顯高于相應單肽誘導的殺傷效應。提示人肝素酶MAP肽能激發(fā)較相應單肽更強的特異性抗腫瘤效應;肝素酶MAP肽誘導的CTL反應具有肝素酶特異性且受HLA-A2.1限制。進一步檢測了肝素酶特異性CTL對少量表達肝素酶的自體淋巴細胞和DC是否具有免疫殺傷效應,結果表明無論是肝素酶MAP肽誘導的效應細胞,還是相應單肽誘導的效應細胞,均對上述兩種靶細胞無明顯殺傷效應,提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT檢測效應細胞IFN-γ的分泌情況,結果表明MAP肽可以誘導更多的效應細胞產生IFN-γ。在刪除CD4~+T淋巴細胞后,肝素酶MAP肽及相應單肽誘導效應細胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4~+T淋巴細胞在CD8+ T淋巴細胞的生成過程中具有重要作用。 3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特異性CTL對肝素酶陽性且H-2K~b陽性的EL-4淋巴瘤細胞、Lewis肺癌細胞以及B16黑色素瘤細胞具有明顯的殺傷效應,且小鼠肝素酶MAP肽誘導的殺傷效應明顯高于相應單肽誘導的殺傷效應;而對肝素酶陽性但H-2K~b陰性的P815肥大細胞瘤細胞不具有殺傷效應,對少量表達肝素酶的自體淋巴細胞和mDC亦不具有殺傷效應。進一步采用ELISPOT檢測肝素酶特異性效應細胞IFN-γ的分泌能力,結果顯示肝素酶MAP肽促進效應細胞IFN-γ的分泌能力明顯高于相應的單肽;在刪除CD4~+T淋巴細胞后,上述效應細胞IFN-γ分泌水平均明顯下降。 4、在體研究小鼠肝素酶MAP肽及其相應的單肽對小鼠的免疫保護及免疫治療效應。免疫保護效應結果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相應的單肽免疫保護組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于陰性肽組及未保護組(PBS組)(p0.05),且MAP肽組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于相應單肽組(p0.05),提示小鼠肝素酶MAP肽對荷瘤小鼠免疫保護效應高于相應的單肽組。免疫治療效應結果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相應的單肽免疫治療組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于陰性肽組及未治療組(PBS組)(p0.05),且多抗原肽組小鼠皮下腫瘤體積小于相應單肽組(p0.05),提示小鼠肝素酶多抗原肽對荷瘤小鼠免疫治療效應強于相應的單肽組。進一步研究肝素酶多肽疫苗對荷瘤小鼠的生存時間的影響,結果表明,肝素酶MAP肽組荷瘤小鼠生存時間明顯長于陰性肽組及未治療組(PBS組),同樣長于相應的單肽組。 [結論] 1、采用標準固相肽合成法(SPSS)合成三條人及兩條小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa(525-533)(PAFSYSFFV),MAP4-Hpa(277-285)(KMLKSFLKA), MAP4-Hpa(405-413)(WLSLLFKKL), MAP4-mHpa(398-405)(LSLLFKKL), MAP4-mHpa (519-526) (FSYGFFVI)]及相應的單肽,采用反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)分析其純度,采用液相色譜/質譜聯用(LC/MS)測其分子量。結果表明合成的多抗原肽及相應單肽的純度達到國際多肽實驗標準,所合成的肽的分子量理論值與實測值無明顯差異,為我們所需的目的多肽。 2、無論人還是小鼠的肝素酶MAP肽體外及離體均可誘導產生較相應單肽更強的抗腫瘤反應,這種抗腫瘤免疫效應是肝素酶特異、且受MHC限制。肝素酶特異性CTL,無論是MAP肽誘導的,還是相應單肽誘導的,對少量表達肝素酶的自體淋巴細胞和DCs均無明顯的殺傷效應,提示這種疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促進效應細胞IFN-γ的分泌能力強于相應的單肽,這種IFN-γ分泌能力在CD4~+T淋巴細胞刪除后明顯減少,提示肝素酶MAP可以通過促進IFN-γ的分泌以增強非特異性的抗腫瘤效應,CD4~+T淋巴細胞在CD8+T淋巴細胞的生成過程中發(fā)揮重要作用。 3、體內研究證實小鼠肝素酶MAP肽可以增強荷瘤鼠的免疫保護及免疫治療效應,并且可以明顯增加荷瘤鼠的生存率,延長荷瘤鼠的生存時間。 以上研究表明,肝素酶MAP肽不僅能激發(fā)較相應單肽更強的特異性的抗腫瘤效應,而且還能誘導一個較相應單肽更強的非特異性抗腫瘤的良性循環(huán),這種肝素酶MAP疫苗具有高效、特異、安全的特點,為肝素酶MAP肽疫苗的臨床應用提供了理論和實驗依據。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1608842