本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點(diǎn)：T細(xì)胞受體　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 結(jié)核病(tuberculosis, TB)至今仍是威脅人類健康的主要傳染病。近年來(lái),由于人口流動(dòng)性的增加、結(jié)核病控制措施的不完善以及耐藥和多重耐藥(MDR)結(jié)核菌株的產(chǎn)生和流行,導(dǎo)致結(jié)核病死灰復(fù)燃,成為感染率最高、病死率僅次于艾滋病的傳染病。當(dāng)前我國(guó)人口的結(jié)核感染率高達(dá)44.5%,估算全國(guó)活動(dòng)性肺結(jié)核病人500萬(wàn),位居全球第二位。我國(guó)結(jié)核病的治療仍以化療為主,存在療程長(zhǎng)、毒副作用大等缺點(diǎn),而且越來(lái)越多的結(jié)核病患者對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致結(jié)核病患者久治不愈。因此,亟需開創(chuàng)新的對(duì)耐藥患者和結(jié)核免疫缺陷患者有效的治療方法! 結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)屬胞內(nèi)寄生菌,體液免疫難以對(duì)其發(fā)揮作用。機(jī)體內(nèi)結(jié)核桿菌的清除需要固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)作用。iNKT細(xì)胞作為T細(xì)胞的亞群之一,不僅是天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁,而且是機(jī)體抗結(jié)核感染的第一道防線,在早期的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中具有重要的保護(hù)作用。結(jié)核病灶中的iNKT細(xì)胞被活化后,既能釋放γ-干擾素(interferon-γ, IFN-y)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)等細(xì)胞因子,激活和趨化巨噬細(xì)胞,提高其抗原遞呈能力和對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌的殺滅；又能通過穿孔素和顆粒酶B (granzyme B, GrB)途徑直接殺傷感染的靶細(xì)胞,發(fā)揮細(xì)胞毒作用,清除胞內(nèi)寄生的結(jié)核菌。另外,iNKT細(xì)胞還參與結(jié)核肉芽腫的形成,有效地減少機(jī)體損傷,防止結(jié)核桿菌的擴(kuò)散。 然而,研究發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核的小鼠體內(nèi)iNKT細(xì)胞數(shù)量減少,且iNKT細(xì)胞失去免疫效力；在活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)iNKT細(xì)胞數(shù)量下降、功能被抑制。因此,在結(jié)核感染早期提高患者體內(nèi)iNKT細(xì)胞的數(shù)量和增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的抗菌活性可能成為抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的有前景的治療策略。 作為T細(xì)胞的亞群,iNKT細(xì)胞同樣依賴其表面抗原受體(T cell receptor, TCR)識(shí)別抗原。人iNKT細(xì)胞表面的TCR恒定表達(dá)Va24J18/Vβ11,識(shí)別抗原譜窄,僅能識(shí)別CDld分子遞呈的糖脂質(zhì)抗原；由于結(jié)核桿菌表面并不含有CDld分子識(shí)別的糖脂質(zhì)抗原,機(jī)體感染結(jié)核桿菌以后,iNKT細(xì)胞的活化需要依賴于巨噬細(xì)胞分泌的內(nèi)源性糖脂質(zhì)抗原iGb3。這些限制了iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核活性。因此人為賦予iNKT細(xì)胞特異性的抗原識(shí)別能力,增加iNKT細(xì)胞的抗原識(shí)別譜,可以為iNKT細(xì)胞應(yīng)用于早期結(jié)核免疫治療開辟新的途徑。 目前,抗原特異的TCR基因修飾MHC限制性T細(xì)胞和γδT細(xì)胞已得到證實(shí)。我們?cè)谇捌谝惨殉晒媒Y(jié)核抗原特異的TCR基因修飾T細(xì)胞,并獲得良好的抗結(jié)核活性。為增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核活性并賦予其特異的殺傷能力,我們利用結(jié)核桿菌38kDa抗原特異的CD8+T細(xì)胞的TCR基因修飾iNKT細(xì)胞,使其表達(dá)抗原特異的TCR,通過MHC-1分子遞呈抗原發(fā)揮免疫效應(yīng)。 然而,TCR基因修飾同時(shí)仍存在一些問題,通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法使本已表達(dá)TCR (Vα24J18/Vβ11)的iNKT細(xì)胞被強(qiáng)制性配備額外的TCRα、β鏈,可能導(dǎo)致內(nèi)外源性TCRα、β錯(cuò)配。因此,細(xì)胞表面理論上將存在四種類型的TCR,即內(nèi)源性TCR、外源性TCR、內(nèi)源性p與外源性α錯(cuò)配產(chǎn)生的雜合TCR、內(nèi)源性α與外源性β錯(cuò)配產(chǎn)生的雜合TCR,因錯(cuò)配的TCR沒有經(jīng)過胸腺的陰性選擇,可能具有自身免疫性,且胸腺外尚未發(fā)現(xiàn)任何機(jī)制可以清除攜帶自身免疫TCR的T細(xì)胞,故內(nèi)、外源性TCR錯(cuò)配增加了自身免疫的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),四種類型的TCR將競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面恒定量的CD3分子及信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),稀釋了外源治療性TCR的作用。 在本實(shí)驗(yàn)中,為使TCRα、β雙鏈均衡表達(dá)和避免內(nèi)、外源性TCR的錯(cuò)配,我們?cè)诓桓淖僒CR功能的前提下,利用2A多肽連接a、p雙鏈,利用鼠C區(qū)的九個(gè)氨基酸替換人TCRC區(qū)相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸。之后,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將改建后的結(jié)核38kDa抗原特異的TCR轉(zhuǎn)染到iNKT細(xì)胞中,與未轉(zhuǎn)染的iNKT細(xì)胞比較,TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞在體外能特異有效地對(duì)38kDa抗原起作用,這些結(jié)果表明,TCR基因修飾iNKT細(xì)胞被賦予了特異的識(shí)別和殺傷活性。 目的 研究結(jié)核抗原38kDa特異TCR基因修飾iNKT細(xì)胞體外抗結(jié)核活性,為開展結(jié)核特異TCR基因修飾iNKT細(xì)胞體內(nèi)抗結(jié)核作用研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為其他胞內(nèi)菌感染、腫瘤、病毒感染等疾病利用iNKT細(xì)胞進(jìn)行免疫治療提供平臺(tái)。 方法 1.篩選結(jié)核抗原38kDa特異TCR ①淋巴細(xì)胞分離液分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);②貼壁法獲取DC,IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)DC成熟；③磁珠分選出CD8+T細(xì)胞；④38kDa抗原刺激DC三輪,誘導(dǎo)抗原特異CD8+T細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增；⑤提取CD8+T細(xì)胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;⑥利用基因掃描(GeneScan)監(jiān)測(cè)刺激前后CDR3譜型變化,找出刺激后單克隆擴(kuò)增的抗原特異的CD8+T細(xì)胞TCR基因家族。 2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒 ①根據(jù)GeneBank報(bào)道的人α、p基因家族可變區(qū)(variable region, V)和恒定區(qū)(constant region, C)基因序列,設(shè)計(jì)α、p鏈基因全長(zhǎng)序列引物,擴(kuò)增特異性TCR a、β全長(zhǎng)基因；②采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的最小突變C區(qū)(其中9個(gè)氨基酸被鼠C區(qū)相位點(diǎn)的氨基酸替換)替換人a、β全長(zhǎng)基因的C區(qū)；③利用重組PCR技術(shù),將已最小突變TCR a、β基因通過自剪切多肽2A連接,并克隆至pGEM-T載體測(cè)序鑒定。④將測(cè)序正確的a、p全長(zhǎng)基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP,酶切鑒定；⑤采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法,包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒,低溫差速離心法濃縮病毒；⑥重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒感染NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)量,計(jì)算重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。計(jì)算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞總數(shù)×GFP陽(yáng)性率／病毒濃縮液量(m1)。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染iNKT細(xì)胞 ①采用Ficoll密度梯度離心法,分離健康志愿者外周血PBMC, IL-2和KRN7000擴(kuò)增iNKT細(xì)胞；②磁珠分選iNKT細(xì)胞；③重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染iNKT細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,確定最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI;④以最佳MOI將重組病毒轉(zhuǎn)染iNKT細(xì)胞；⑤利用PE熒光染料標(biāo)記的小鼠抗人TCR-Vβ5單抗,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iNKT細(xì)胞表面結(jié)核特異TCR的表達(dá)。 4.TCR基因修飾iNKT細(xì)胞活性測(cè)定 按不同效靶比(effector:target, E:T),將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞與負(fù)載38kDa的DC混合培養(yǎng),以未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的iNKT細(xì)胞為陰性對(duì)照,以雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA)和ESAT-6(early secreted antigenic target,6kDa)為非特異性抗原對(duì)照；酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)iNKT細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、 TNF-α、 GrB的分泌水平,利用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolved fluoroimmuno-assay, TRFIA)技術(shù),檢測(cè)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞對(duì)負(fù)載38kDa抗原DC的殺傷活性。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析(One-WayANOVA)比較iNKT細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平以及殺傷水平,方差不齊時(shí)用Welch校正,組間兩兩比較方差齊時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Dunnett'sT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS17.0for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果 1.分析刺激前后CDR3譜型,篩選抗原特異TCR CDR3譜型分析表明,結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原刺激前各TCR Va (α chain variable gene)、 Vβ (β chain variable gene)基因家族的CDR3譜型均呈8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布(Gaussian distribution),表明各家族均為多克隆性。而38kDa抗原刺激后,部分基因家族譜型發(fā)生改變,呈現(xiàn)偏態(tài)或者單峰分布,表明這些家族是由于38kDa抗原持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化,找出刺激前為多克隆,刺激后呈單克隆擴(kuò)增的Vα9、Vβ5基因家族。 2.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建以及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染滴度的測(cè)定 成功擴(kuò)增出經(jīng)最小突變的TCRα9、 β5全長(zhǎng)基因,經(jīng)TA克隆后測(cè)序,TCRα9、β5基因V區(qū)DNA序列與GeneBank報(bào)道的V區(qū)序列完全一致,C區(qū)的基因序列與預(yù)期相符。利用自剪切多肽2A,通過重組PCR,擴(kuò)增出CD8+T細(xì)胞的hVβ5mCβ-2A-hVa9mCa融合基因,將其插入pMX-IRES-GFP,構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMX-hVp5mCβ-2A-hVa9mCa-IRES-GFP,酶切鑒定證實(shí)基因片段插入正確。將其與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293,48h后取病毒上清,濃縮純化后感染NIH3T3細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、計(jì)算得重組病毒滴度分別為1.97×107IU/ml。 3.TCR基因修飾iNKT細(xì)胞 按不同的MOI,將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染iNKT細(xì)胞。MOI=8時(shí),相差顯微鏡下觀察基因修飾的iNKT細(xì)胞高表達(dá)GFP。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞GFP的陽(yáng)性表達(dá)率為36.7%,外源性TCR Vβ5的陽(yáng)性表達(dá)率為60.9%。。 4.TCR基因修飾iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核抗原活性 ①TCR基因修飾iNKT細(xì)胞IFN-y分泌水平 iNKT細(xì)胞IFN-y分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化,在E：T=7,共培養(yǎng)18h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞IFN-y分泌水平達(dá)最高值。按E：T=7,將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞與負(fù)載抗原的DC的混合培養(yǎng)18h,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IFN-y的分泌。結(jié)果顯示,IFN-y的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=814.923,P=0.000)。38kDa抗原特異TCR基因修飾組IFN-y分泌量(2225.954±53.655pg/ml)顯著高于其它各組,與各對(duì)照組相比有顯著性差異。 ②TCR基因修飾iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平 iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化,在E：T=20,共培養(yǎng)24h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平達(dá)最高值。按E：T=20,將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)載38kDa的DC混合培養(yǎng)24h,ELISA檢測(cè)上清中TNF-α的分泌。結(jié)果顯示,TNF-α的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=l787.767,P=0.000).38kDa抗原特異TCR基因修飾組TNF-a分泌量(1299.701±13.183pg/ml)顯著高于其它各組,與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。 ③TCR基因修飾iNKT細(xì)胞GrB分泌水平 iNKT細(xì)胞GrB分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化,在E：T=20,共培養(yǎng)24h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞GrB分泌水平達(dá)最高值。按E：T=20,將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)載38kDa的DC混合培養(yǎng)24h,ELISA檢測(cè)上清中GrB的分泌。結(jié)果顯示,GrB的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21635.892, P=0.000)。38kDa抗原特異TCR基因修飾組GrB分泌量(11.3643±0.031pg/ml)顯著高于其它各組,與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。 ④TCR基因修飾iNKT細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞對(duì)負(fù)載38kDa抗原DC的殺傷活性,結(jié)果顯示,38kDa抗原特異TCR基因修飾組iNKT細(xì)胞殺傷水平隨E：T的增大而升高,在E：T=30,共培養(yǎng)4h時(shí),38kDa特異TCR基因修飾組iNKT細(xì)胞殺傷活性最高。按E：T=30,將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)載38kIDa抗原的DC混合培養(yǎng)4h,時(shí)間分辨熒光免疫法分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、無(wú)關(guān)抗原組、相關(guān)抗原組、38kDa抗原組iNKT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果表明,各組間iNKT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=87.375, P=0.000)。LSD多重比較結(jié)果提示,38kDa抗原組iNKT細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng),與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。 結(jié)論 ①本研究利用結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原體外刺激正常人外周血CD8+T細(xì)胞,獲得38kDa抗原特異TCR,擬轉(zhuǎn)入iNKT細(xì)胞,人為賦予其特異性的抗原識(shí)別能力。由于轉(zhuǎn)入的TCRα、β鏈可能與內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配,為減少內(nèi)外源性TCRα/β鏈錯(cuò)配的機(jī)率,利用本實(shí)驗(yàn)室已成功設(shè)計(jì)出最小突變C區(qū)替換人TCRαp鏈的C區(qū)。我們將TCR基因轉(zhuǎn)染自體iNKT細(xì)胞并檢測(cè)其活性,研究表明抗原特異TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞在體外具有顯著的抗結(jié)核抗原活性。 ②本研究首次證實(shí)了TCR基因轉(zhuǎn)染iNKT細(xì)胞的可行性,為iNKT細(xì)胞的細(xì)胞免疫治療提供了新方法,同時(shí)也為其它胞內(nèi)菌感染性疾病的免疫治療研究提供了平臺(tái)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378.911;R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1608729