本文選題：神經(jīng)絲M　切入點(diǎn)：單克隆抗體　出處：《山東大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：制備抗神經(jīng)絲中分子量亞單位(NF-M)的單克隆抗體(McAb),為神經(jīng)絲檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。 方法：將人、大鼠、小鼠NF-M氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),選擇合適的氨基酸序列GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C進(jìn)行多肽合成,合成后的多肽通過(guò)Sulfo-SMCC與匙孔槭血藍(lán)蛋白(KLH)載體蛋白偶聯(lián)。將偶聯(lián)后的多肽KLH-NF-M作為抗原,以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用福氏完全佐劑乳化抗原,其后的免疫使用福氏不完全佐劑乳化,每隔2周免疫一次。多次免疫后,小鼠內(nèi)眥取血,離心取血清。以NF-M多肽包被酶標(biāo)板,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠外周血中抗體效價(jià)。選擇血清抗體效價(jià)高的小鼠,進(jìn)行脾內(nèi)免疫,3天后處死小鼠,取其脾細(xì)胞。采用細(xì)胞融合技術(shù),PEG4000為融合劑,將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0細(xì)胞)融合。使用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中McAb,對(duì)分泌抗NF-M的McAb的細(xì)胞株以有限稀釋法進(jìn)行克隆化。獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。以競(jìng)爭(zhēng)抑制,免疫學(xué)方法對(duì)該McAb亞類進(jìn)行鑒定。以NF-M多肽為競(jìng)爭(zhēng)抗原應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)檢測(cè)McAb的特異性。將正常大鼠大腦組織勻漿后上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為一抗,進(jìn)行Western blot試驗(yàn),檢測(cè)抗體與大腦組織中的NF-M特異性結(jié)合的能力。以正常大鼠大腦作石蠟切片,以雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為一抗,進(jìn)行免疫組化試驗(yàn),進(jìn)一步鑒定該單克隆抗體的特異性。 結(jié)果：BALB/c小鼠經(jīng)腹腔免疫4次后,ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)為1：512000。經(jīng)細(xì)胞融合后,融合率為46.61%, ELISA檢測(cè)抗體陽(yáng)性率7.26%。對(duì)分泌抗NF-M的陽(yáng)性細(xì)胞株有限稀釋法克隆化3-5次后,單克隆孔抗體分泌陽(yáng)性率達(dá)到100%,建立了一株能穩(wěn)定分泌抗NF-M的雜交瘤細(xì)胞株2C1。經(jīng)單克隆抗體亞類鑒定2C1所產(chǎn)生的抗體為IgG1。多肽競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)果：競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線為y=0.4127x+0.2691,相關(guān)系數(shù)r=0.9912,證明McAb是針對(duì)NF-M的。Western blot實(shí)驗(yàn)在160KD分子量附近可見一條清楚的蛋白條帶,與NF-M分子量大小相符。表明該McAb與正常大鼠大腦勻漿中的NF-M蛋白有較好的特異性反應(yīng)。正常大鼠大腦及脊髓石蠟切片的免疫組化結(jié)果顯示,神經(jīng)元胞核周圍棕褐色著色顆粒,表明該McAb與正常大鼠大腦切片組織中的NF-M有特異性反應(yīng)。 結(jié)論：制備了特異性抗NF-M的McAb,該McAb在Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)中均與大鼠NF-M特異性結(jié)合,可用于NF-M診斷試劑的研制。
[Abstract]:Aim: to prepare monoclonal antibody against NF-M in neurofilament, and to lay a foundation for the establishment of a method for the detection of neurofilament. Methods: the amino acid sequences of human, rat and mouse NF-M were compared, and the suitable amino acid sequence GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C was selected for peptide synthesis. The synthesized polypeptide was coupled with the carrier protein of Acer mono hemocyanin (KLH) by Sulfo-SMCC. KLH-NF-M was used as antigen to immunize BALB/c mice by intraperitoneal injection. Freund's complete adjuvant emulsified antigen was used for the first time. After repeated immunization, the blood was collected from the inner canthus of the mice, and the serum was collected by centrifugation. The enzyme labeled plate was coated with NF-M polypeptide, and then the adjuvant was emulsified by Freund's incomplete adjuvant. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) was used to determine the antibody titers in peripheral blood of mice. Mice with high antibody titer were selected. The mice were killed after 3 days of intrasplenic immunization, and the spleen cells were taken out. PEG4000 was used as fusion agent. HAT medium was used to screen hybridoma cells. Elisa was used to detect McAbs in the culture supernatant of hybridoma cells. The cell lines secreting McAb against NF-M were cloned by limited dilution method. To obtain hybridoma cell lines which can secrete monoclonal antibody stably. The subclass of McAb was identified by immunological method. The specificity of McAb was detected by competitive inhibition test with NF-M polypeptide as competitive antigen. After homogenate of normal rat brain tissue was sampled, SDS-PAGE electrophoresis was performed, and then transferred to PVDF membrane. The Western blot test was carried out to detect the ability of the antibody to bind to the specific NF-M in the brain tissue. The normal rat brain was used as paraffin section, and the antibody produced by the hybridoma cell was used as the first antibody. The specificity of the monoclonal antibody was further identified by immunohistochemistry. Results after 4 times of intraperitoneal immunization, the titer of serum antibody detected by Elisa was 1: 512000. After cell fusion, the fusion rate was 46.61.The positive rate of ELISA antibody was 7.26.The antibody was cloned by limited dilution method for 3-5 times. A hybridoma cell line 2C1, which can stably secrete anti NF-M, was established. The antibody produced by 2C1 was identified as IgG1 by monoclonal antibody subclass. The result of peptide competition inhibition: the competitive inhibition curve was 0.4127x. The correlation coefficient is 0.2691 and the correlation coefficient is 0.9912. It is proved that McAb is a clear protein band near the molecular weight of 160KD. The molecular weight of McAb was consistent with the molecular weight of NF-M. It showed that the McAb had a good specific reaction with the NF-M protein in the brain homogenate of normal rats. The immunohistochemical results of paraffin sections of brain and spinal cord of normal rats showed that the brown stained granules around the nucleus of neurons were brown. The results showed that the McAb had a specific reaction with NF-M in normal rat brain tissue. Conclusion: McAbs with specific anti NF-M have been prepared. The McAb binds specifically to rat NF-M in Western blot and immunohistochemistry experiments, and can be used in the development of NF-M diagnostic reagent.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1607672