本文選題：肝炎　切入點：ConA　出處：《第二軍醫(yī)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：【研究背景及目的】 肝炎是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的肝臟疾病之一,可由多種原因引起,如病毒感染、自身免疫功能紊亂、酗酒、藥物毒性、營養(yǎng)不良和膽汁淤積等,我國是肝炎高發(fā)國家,大部分肝炎是病毒感染引起,尤其是以HBV感染為主。病毒性肝炎的主要發(fā)病機制是病毒抗原進入機體后引起的免疫反應(yīng)造成肝細胞損傷,以細胞免疫反應(yīng)為主,主要的效應(yīng)細胞是特異性細胞毒性T淋巴細胞。病人免疫狀況不同導(dǎo)致肝炎的臨床表現(xiàn)各異。急性肝損傷(Acute liver failure)是由急性重型病毒性肝炎引起的致死性很高的肝臟疾病,病死率高達40-80%。大多數(shù)慢性病毒性肝炎病人在接受長期藥物治療后最終仍會發(fā)展為肝硬化、肝癌,肝臟的慢性炎癥是導(dǎo)致肝癌的重要原因,因此對病毒性肝炎的研究具有重要的臨床意義。自身免疫性肝炎(AIH)是一種病因不明的肝臟慢性炎癥疾病,在西方國家發(fā)病率較高,目前認為細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)均參與了其發(fā)病機制,細胞毒性T細胞是主要的致病因素,多數(shù)患者最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。 刀豆蛋白A(ConA)是一種植物蛋白成分提取物,T淋巴細胞表面有其受體,為TCR、CD3等在內(nèi)的糖蛋白的糖殘基,肝臟是ConA作用的靶器官之一。由于肝內(nèi)存在Kupffer細胞、T細胞等大量免疫細胞,因此尾靜脈注射后ConA能夠經(jīng)血液循環(huán)特異性地與肝竇內(nèi)T細胞表面的受體結(jié)合并引起T細胞活化,從而導(dǎo)致肝臟炎癥及損傷。ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高以及嚴重的肝臟病理損傷,可以很好地模擬病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等各種主要由免疫因素介導(dǎo)的肝臟疾病。 由于解剖學上的聯(lián)系,肝臟長期暴露于較低濃度的腸道細菌及細菌產(chǎn)物的刺激下,并且肝臟是最主要的腸道菌群過濾器官。肝臟內(nèi)有大量的免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞以及B淋巴細胞,因此正常肝臟能夠迅速有效地清除腸道來源的細菌及細菌產(chǎn)物。然而,當肝臟的功能受損時,腸源性細菌產(chǎn)物可通過門靜脈或其側(cè)支循環(huán)進入血液形成內(nèi)毒素血癥。腸源性內(nèi)毒素是強有力的致炎因子,能夠引起肝內(nèi)大量免疫細胞的活化,從而引起肝內(nèi)大量炎癥因子的分泌,這些炎癥因子加重了肝臟已有炎癥的發(fā)生、發(fā)展。 內(nèi)毒素(LPS)通過其受體Toll樣受體4(TLR4)發(fā)揮作用。TLR4與LPS結(jié)合后,通過MyD88通路和TRIF通路活化下游信號,前者可引起多種炎癥介質(zhì)的釋放,后者則可引起I型和II型干擾素的釋放。在肝臟中,TLR4也表達于Kupffer細胞、星狀細胞、膽管上皮細胞、內(nèi)皮細胞和樹突狀細胞,在多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。 本課題擬應(yīng)用ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型研究腸源性內(nèi)毒素在免疫因素介導(dǎo)的肝炎中的作用,同時建立TLR4敲除的小鼠ConA肝炎模型,探討腸源性內(nèi)毒素LPS在本模型中的作用機制,為病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等免疫因素介導(dǎo)肝炎的防治提供有潛在臨床價值的實驗數(shù)據(jù)。 【實驗方法】 1.建立ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型,檢測注射ConA后小鼠體內(nèi)LPS水平; 2.利用抗生素清除腸源性內(nèi)毒素,比較抗生素處理組和對照組小鼠ConA引起的肝損傷程度和LPS水平的變化; 3.用抗生素清除小鼠腸源性內(nèi)毒素,比較抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后肝臟內(nèi)T細胞的浸潤情況以及CD4~+ T細胞的活化情況; 4.用ELISA方法檢測抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后血清中Th1和Th2相關(guān)細胞因子的表達情況; 5.用Western Blot方法檢測抗生素處理組和對照組小鼠注射ConA后肝臟組織中相關(guān)促進和抑制凋亡分子的表達情況; 6.比較LPS受體Toll樣受體4(TLR4)敲除小鼠和對照小鼠的ConA引起的肝損傷程度; 7.用流式細胞儀檢測TLR4敲除小鼠和對照小鼠肝臟內(nèi)參與引起ConA肝炎的T細胞的浸潤情況以及CD4~+ T細胞的活化情況; 8.分離TLR4敲除小鼠和對照小鼠脾細胞以及分選純化CD4~+ T細胞,體外實驗驗證ConA對CD4~+ T細胞活化的影響; 9.用ELISA方法檢測TLR4敲除小鼠和對照小鼠注射ConA后血清中Th1和Th2相關(guān)細胞因子的表達情況;用Real-time PCR方法檢測Th1細胞分化調(diào)節(jié)分子T-bet的表達情況; 10.用Western Blot方法檢測TLR4敲除小鼠和對照小鼠注射ConA后肝臟組織中相關(guān)促進和抑制凋亡分子的表達情況;用Real-time PCR方法檢測穿孔素Perforin和Granzyme B的表達情況。 【實驗結(jié)果】 1.在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中存在血清LPS水平的升高; 2.抗生素處理組小鼠在ConA注射后血清中LPS的升高明顯低于對照組,并且利用抗生素清除腸源性LPS可明顯減輕ConA引起的肝臟損傷及肝細胞凋亡; 3.清除腸源性LPS能夠明顯降低ConA引起的肝內(nèi)T細胞浸潤以及CD4~+ T細胞的活化; 4.清除腸源性LPS能夠抑制ConA引起的Th1相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生; 5.清除腸源性LPS能夠明顯抑制ConA引起的肝細胞凋亡; 6. TLR4缺失明顯減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷和肝細胞的凋亡; 7. TLR4缺失抑制T細胞的肝內(nèi)浸潤并能有效抑制CD4~+ T細胞的活化; 8. TLR4缺失能夠抑制ConA引起的Th1相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生,而促進Th2相關(guān)細胞因子IL-10的產(chǎn)生; 9. TLR4缺失能夠明顯抑制ConA引起的肝細胞凋亡; 10.穿孔素/顆粒酶B途徑可能參與了TLR4缺失對肝細胞凋亡的保護作用。 【結(jié)論】 本研究證明腸源性LPS在ConA誘導(dǎo)的免疫因素介導(dǎo)肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。腸源性LPS通過與其受體TLR4結(jié)合,促進ConA引起的肝內(nèi)T細胞浸潤以及肝臟中的CD4~+ T細胞的活化,繼而促進一系列Th1相關(guān)細胞因子的生成,從而加重ConA引起的小鼠肝損傷;清除腸源性LPS和TLR4缺失小鼠在ConA處理后肝臟損傷較輕,并且肝內(nèi)T細胞浸潤明顯減輕,CD4~+ T細胞的活化和體內(nèi)Th1相關(guān)細胞因子水平明顯低于對照組,而對Th1相關(guān)細胞因子有拮抗作用的Th2相關(guān)細胞因子IL-10有明顯升高。清除腸源性LPS和TLR4缺失能夠上調(diào)Mcl-1的表達而下調(diào)Bax的表達,并能夠增強Erk1/2的磷酸化,從而減輕ConA引起的肝細胞凋亡,穿孔素/顆粒酶B途徑可能參與了TLR4缺失對肝細胞凋亡的保護作用。我們的實驗結(jié)果提示抑制腸道細菌的異常轉(zhuǎn)位以及清除腸源性LPS可能會有效改善肝炎病人的肝功能,減輕肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.1;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 John Almeida;Sumedha Galhenage;Jennifer Yu;Jelica Kurtovic;Stephen M Riordan;;Gut flora and bacterial translocation in chronic liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2006年10期

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本文編號：1601515