本文選題：惡性瘧原蟲　切入點：瘧疾疫苗　出處：《第二軍醫(yī)大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：瘧疾仍是嚴重危害人類健康的寄生蟲病。由于瘧原蟲抗藥性的產生和擴散,以及蚊媒對殺蟲劑產生抗性并逐漸蔓延,使得傳統(tǒng)的瘧防措施面臨嚴峻挑戰(zhàn)。研發(fā)安全、有效的瘧疾疫苗是當今最有希望的瘧疾防治方法之一。瘧疾相關流行病學調查以及實驗室研究結果均表明,研制有效的瘧疾疫苗是可行的。長期在瘧疾流行區(qū)生活的居民體內可以產生針對瘧疾的免疫力,在高瘧區(qū),10歲以上的人群極少發(fā)生重癥瘧疾。從長期生活在西非瘧疾流行區(qū)的成年人體內提取的IgG,被動免疫治療重癥瘧疾患兒,能使其外周血原蟲密度降低99%。此外,給志愿者反復接種經輻照減毒的瘧原蟲子孢子,可使人體產生完全的保護性免疫力。這些研究結果為研制有效瘧疾疫苗提供了重要依據(jù)。瘧疾疫苗研究已進行了近三十年,目前已鑒定了一批包含瘧原蟲生活史各期的疫苗候選抗原。這些抗原在動物試驗中都能產生較高水平的特異性抗體,并且在體外或動物模型中顯示出不同程度的保護效力,其中一些疫苗候選抗原已進入臨床研究,并顯示出較好的免疫保護效果,如以惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白為基礎的RTS,S瘧疾疫苗已進入III期臨床試驗,其疫苗制劑RTS,S/ AS01E在非洲兒童中進行的臨床試驗顯示出一定的保護力(39.2%～45.8%),能持續(xù)15個月以上。然而,瘧疾疫苗研發(fā)仍面臨一些的困難,包括:(1)瘧疾免疫保護機制尚不清楚,現(xiàn)有疫苗候選抗原免疫原性較弱,單獨使用不能產生有效的免疫保護效力;(2)缺乏有效的動物模型以評價疫苗的體內免疫保護效力;(3)瘧原蟲抗原變異和存在多種免疫逃避的機制;(4)缺乏強效人用疫苗佐劑等。 研制由瘧原蟲生活史多個時期抗原組成的多期聯(lián)合疫苗是當今瘧疾疫苗的發(fā)展趨勢。由于瘧原蟲生活史復雜,瘧原蟲抗原有明顯期特異性和株間變異,因此普遍認為,一個有效的疫苗需要由針對多個生長環(huán)節(jié)的抗原組成,這樣可增強疫苗的有效性和克服瘧原蟲變異性等問題。特別是將紅內期抗原與紅外期抗原聯(lián)合,這種聯(lián)合疫苗對紅內期和紅外期原蟲均能產生殺滅作用。此外,選用合適的人用佐劑也是瘧疾疫苗研發(fā)的重要內容。研究已表明,瘧疾保護性免疫需要相當高的免疫應答反應。因此需要尋找或研制一種能在人體應用的強效佐劑,并與瘧疾疫苗抗原聯(lián)合應用。 本實驗室在瘧疾疫苗研發(fā)方面已開展了系列工作。PfCP-2.9抗原是由本實驗室設計和研制的一種紅內期瘧疾疫苗候選抗原,該抗原是由惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原1(MSP1)和頂端膜抗原1(AMA-1)的C-末端片段融合而成。在前期的實驗室和臨床研究中,該抗原顯示出良好的發(fā)展前景:(1)在畢氏酵母分泌表達系統(tǒng)中表達產量高,且可溶性和穩(wěn)定性高;(2)在小鼠、家兔、猴動物模型中均顯示較強的免疫原性,在家兔中能誘導產生較單個組分高10倍以上的抗體;(3)家兔和恒河猴的免疫血清在體外有良好的抑制瘧原蟲生長的效力;(4)兩次臨床試驗結果顯示該抗原在人體具有良好的安全性和免疫原性。然而,PfCP-2.9融合抗原的構象是個尚未解決重要問題,特別是這兩個二硫鍵十分豐富的蛋白融合為一個分子后,是否能形成各自的正確構象以及兩個抗原是否存在相互作用等問題,均受到普遍關注。 本研究采用多維核磁共振NMR技術對PfCP-2.9蛋白結構進行解析。我們制備了15N單標記和13C、15N雙標記PfCP-2.9重組蛋白以及15N單標記PfMSP119重組蛋白,通過將融合蛋白中指認的氨基酸化學位移與已知單個組分氨基酸化學位移的對比,分析其結構變化。此外,我們開展了以PfCP-2.9和PfCSP-2抗原為基礎的多期聯(lián)合疫苗的免疫學和臨床前研究。本研究取得主要結果如下: (一)PfCP-2.9疫苗候選抗原的結構解析 為研究PfCP-2.9抗原的三維結構,我們在畢赤酵母表達系統(tǒng)中表達了15N單標記、15N、13C雙標記PfCP-2.9蛋白及15N單標記PfMSP119蛋白,用于NMR分析。在制備樣本的過程中,我們遇到了蛋白降解和表達量低等問題。通過采用小型罐發(fā)酵以及嚴格控制和優(yōu)化發(fā)酵條件等途徑,獲得了用于磁共振分析的蛋白樣品。 HNCA,HNCACB,CBCA(CO)NH,HNCO和HN(CA)CO實驗被用來進行主鏈原子信號指認;HBHA(CO)NH,(H)CC(CO) NH,CC(CO)NH和15N-TOCSY-HSQC實驗被用來進行側鏈原子信號指認。對主鏈碳原子的指認獲得的數(shù)據(jù)如下:分別指認了PfAMA1-III、連接區(qū)、PfMSP119部分的39個、12個和71個氨基酸殘基;同時獲得了部分側鏈的化學位移數(shù)據(jù)。PfAMA1-III部分被指認的殘基定位分散于分子的不同區(qū)域,包含有結構區(qū)域和無序區(qū)域,且許多位于核心結構區(qū)的殘基被指認;PfMSP119部分大多數(shù)氨基酸殘基均被指認。 三維15N-標記NOESY-HSQC波譜實驗用來分析化學位移。絕大多數(shù)PfCP-2.9分子中被指認的氨基酸殘基表現(xiàn)出的化學位移與已報道的單個組分的化學位移高度相似。僅有少量氨基酸的化學位移與已報道的數(shù)據(jù)有較大差異,由于在已報道的PfAMA1-III和PfMSP119的NMR研究中,與本項研究使用的緩沖液條件不同,因此這些差異被考慮為實驗條件差異所致。 將PfCP-2.9與PfMSP119的HSQC圖譜進行重疊,結果顯示PfCP-2.9分子中的PfMSP119的結構與單獨的PfMSP119分子的結構完全一致。除了His150和Ser238殘基,所有氨基酸殘基的化學位移峰的差別都在實驗誤差范圍內。His150和Ser238殘基分別位于兩種分子的N端和C端,易受樣品條件不同的影響。經過對比兩種分子的波譜圖,未發(fā)現(xiàn)任何信號消失。這些數(shù)據(jù)強有力地證明了PfCP-2.9分子中的PfMSP119部分的結構與單獨的PfMSP119分子的結構完全一致。 將15N單標記PfCP-2.9與PfMSP119同時進行橫向馳豫率的測定,結果顯示,位于PfCP-2.9分子的氨基酸殘基的橫向馳豫率整體較高,這是因為PfCP-2.9分子具有較高的分子量和較慢的分子翻轉。將兩種分子中的數(shù)據(jù)進行重疊,發(fā)現(xiàn)兩者有極高的相似度,未在任何區(qū)域發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。該結果提示PfCP-2.9分子中的PfMSP119部分與單獨的PfMSP119分子相比,沒有氨基酸殘基化學或構象的變化,提示PfMSP119部分與PfAMA1-III部分和連接區(qū)部分無微弱的相互作用。 (二)多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學及臨床前研究 為研制多期聯(lián)合瘧疾疫苗,本實驗室前期已構建了惡性瘧原蟲紅外期抗原PfCSP-2。該抗原由由惡性瘧原蟲3D7株的環(huán)子孢子蛋白(CSP)的NANP重復區(qū)及C端部分側翼序列融合而成。在前期的實驗中,該疫苗候選抗原也顯示出良好的發(fā)展前景,包括在畢氏酵母分泌表達系統(tǒng)中高水平表達、蛋白可溶和穩(wěn)定性高、純化制備簡便,并在小鼠、家兔動物模型中均顯示出很高的免疫原性等。在此基礎上本研究開展了多期聯(lián)合疫苗多種動物的免疫學、新型佐劑以及臨床前相關研究: 1.新型佐劑選用:疫苗的組成包括兩個方面,一是抗原,二是佐劑。作為疫苗,佐劑的作用與抗原同等重要,特別是目前尚缺乏人用強效佐劑。為此,本項研究選用了5種人用疫苗佐劑或組合:MF59、GLA、MF59+GLA、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑+CpG,并在小鼠和恒河猴體內進行了佐劑比較研究。 BALB/c小鼠8組,每組8只小鼠,分別免疫MF59+GLA、MF59、GLA、ISA720、弗氏佐劑、鋁佐劑、鋁佐劑+GLA與PfCP-2.9蛋白的疫苗制劑。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結果顯示除了弗氏佐劑和ISA720兩種非人用佐劑外,鋁佐劑+GLA+抗原組特異性抗體水平最高,從該組免疫血清中純化的抗體顯示出一定的體外抑制原蟲生長效力。 恒河猴5組,每組3只恒河猴,分別免疫ISA720、鋁佐劑+CpG、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑、MF59+GLA與PfCP-2.9+PfCSP-2蛋白的疫苗制劑。大腿肌肉注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,實驗結果顯示鋁佐劑+GLA組PfCP-2.9特異性抗體水平最高,其純化的抗體顯示出明顯的體外抑制瘧原蟲生長效力。 綜合考慮目前在臨床前及臨床試驗中佐劑應用的實際情況和佐劑的安全性等問題,以及佐劑的實際效果需要在臨床試驗中才能體現(xiàn)等實際情況,經與世界衛(wèi)生組織和美國IDRI專家研討,確定鋁佐劑+GLA為本疫苗的佐劑。 2.兩種抗原劑量配比:在實際應用時,多期聯(lián)合瘧疾疫苗面臨著兩種抗原劑量如何配比的問題,為此我們在小鼠模型中進行了最佳劑量配比實驗。BALB/c小鼠5組,每組6只小鼠,PfCP-2.9:PfCSP-2的量分別為1:1、1:2、2:1、1:4、4:1。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結果顯示抗原配比1:1組PfCP-2.9抗體水平略高,其次為4:1、2:1、1:2、1:4組,統(tǒng)計分析顯示各組間均無顯著差異;第1~4組PfCSP-2抗體水平接近,以抗原配比1:2組略高,其次為1:4、1:1、2:1組,4:1組抗體水平明顯較低,統(tǒng)計分析顯示第1:2、1:4、1:1、2:1組間無顯著差異,但均明顯高于4:1組(p0.05)。綜合上述結果,我們確定兩種抗原以1:1配比進行下階段的實驗。 3.兩種抗原相互競爭性抑制分析:為了分析PfCP-2.9與PfCSP-2抗原聯(lián)合免疫時是否存在相互競爭性抑制作用,我們在小鼠和家兔動物模型中進行了分析。BALB/c小鼠4組,每組6只小鼠;家兔4組,每組5只家兔,分組包括:PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2聯(lián)合組合生理鹽水對照組。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結果顯示單獨的抗原組與聯(lián)合抗原組產生的特異性抗體水平接近,經統(tǒng)計分析均無顯著差異,表明兩種抗原聯(lián)合免疫無明顯競爭性抑制作用。 4.免疫原性及體外抑制效力分析:在確定了合適的佐劑、合適的抗原劑量配比和證實了抗原之間無相互競爭性抑制作用的基礎上,我們在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中開展了由新型佐劑多期與兩個疫苗抗原組成的聯(lián)合瘧疾疫苗(PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA)的免疫原性實驗以及體外抑制原蟲生長效力的分析。BALB/c小鼠4組,每組6只小鼠,分組包括:PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA組、Al+GLA對照組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組、Al對照組;家兔4組,每組5只家兔,分組包括:PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2聯(lián)合組合生理鹽水對照組;恒河猴2組,每組5只恒河猴,分組包括:PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組;頸背部皮下或肌肉注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結果在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中,該疫苗均顯示出良好的免疫原性,能刺激動物產生較高水平的特異性抗體,聯(lián)合佐劑Al+GLA較單獨Al佐劑組抗體水平高,免疫血清能識別天然抗原,并在體外顯示出一定的抑制瘧原蟲生長效力。 5.疫苗穩(wěn)定性初步觀察:為了觀察該新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗的穩(wěn)定性,我們采用以引起動物免疫應答的效力進行評估,即測定半數(shù)有效劑量ED50。該方法是將多價多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原保存在4℃和37℃條件下,取不同時間點的多價多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原,連續(xù)稀釋5個稀釋度,與鋁+GLA佐劑混合后接種BALB/c小鼠,每個稀釋度10只,雌雄各半。4周后采血取血清,用ELISA法測定血清樣本,計算ED50值。結果顯示,4℃條件下6個月內和37℃條件下7天內的疫苗樣品,其半數(shù)有效劑量ED50保持在穩(wěn)定水平,無顯著差異,表明疫苗抗原在凍干狀態(tài)下至少能在4℃條件下6個月內和37℃條件下7天內保持其免疫效力的穩(wěn)定。 小結:多期聯(lián)合瘧疾疫苗是有希望的瘧防新措施,在本實驗室對瘧疾疫苗長期研究的基礎上,本項研究開展了對PfCP-2.9疫苗候選抗原的結構解析和多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學及臨床前研究。結果顯示:(1)AMA1-III和MSP119在PfCP-2.9分子中均具有良好的結構,并維持了其天然構象;(2)PfCP-2.9分子中的AMA1-III和MSP119組分無相互作用;(3)比較了多種人用佐劑的作用,選擇了Al+GLA作為新型疫苗的佐劑;(4)PfCP-2.9與PfCSP-2兩種抗原1:1是合適的抗原配比;兩種抗原在聯(lián)合應用時無明顯的競爭性抑制作用;(5)新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中均顯示出良好的免疫原性,其抗體顯示出一定的體外抑制原蟲生長效果;(6)兩種抗原制劑在凍干狀態(tài)下,至少能在4℃條件下6個月內和37℃條件下7天內保持其免疫效力的穩(wěn)定。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 李偉杰;約氏瘧原蟲Pys25和Pys48抗原在大腸桿菌和家蠶細胞中的表達與初步研究[D];浙江理工大學;2014年

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本文編號：1599165