發(fā)布時間：2018-03-11 08:03

  本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：第三代腺病毒　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，其慢性化及致癌率高，是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。目前尚缺乏有效的HCV預(yù)防性疫苗，這進(jìn)一步增加了HCV的防控難度。HCV具有高度種屬特異性，僅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，致使HCV感染性模型缺乏，嚴(yán)重阻礙了HCV復(fù)制及致病機(jī)制研究、抗病毒藥物及疫苗研制與評價等。建立新型HCV感染性細(xì)胞模型及小動物模型，對HCV基礎(chǔ)及應(yīng)用研究具有重要意義。本研究分別利用Tet-on可誘導(dǎo)系統(tǒng)和第三代腺病毒載體系統(tǒng)，探索并建立了新型HCV感染細(xì)胞模型及小鼠模型，，以期為HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評價等提供一個新的技術(shù)手段。 1.肝組織特異性可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究 (1)可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型的建立及鑒定 人肝嵌合小鼠模型是將人肝細(xì)胞異種移植到受體鼠肝內(nèi)建立的適合于嗜肝病毒體內(nèi)感染研究的小鼠模型，現(xiàn)有的Alb-uPA/SCID轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型，由于在肝組織特異性白蛋白（Albumin）啟動子作用下組成性表達(dá)小鼠尿激酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator, uPA）分子，造成出生小鼠肝損傷，為人肝細(xì)胞的移植及嵌合生長提供了微環(huán)境；但其嚴(yán)重不足之處是小鼠出生時死亡率高達(dá)70%~90%，使得該模型穩(wěn)定性差，繁育及操作難度大。因此，建立繁育和操作簡單、穩(wěn)定性好和死亡率低的模型是發(fā)展該模型的關(guān)鍵。為了降低Alb-uPA/SCID小鼠出生時高死亡率，增強(qiáng)模型穩(wěn)定性，本研究采用Tet-on可誘導(dǎo)系統(tǒng)建立了一種可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人肝嵌合小鼠模型。首先，我們分別構(gòu)建了Tet-on-Albumin和TRE_2-uPA轉(zhuǎn)基因載體，在體外證實(shí)了Albumin啟動子具有體外轉(zhuǎn)錄活性，并且Dox可誘導(dǎo)活性uPA分子表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，我們分別制備了Tet-on-Albumin和TRE_2-uPA兩種轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Albumin啟動子也具有體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，可調(diào)控性rtTA蛋白在Tet-on-Albumin轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織特異性表達(dá)。研究結(jié)果顯示Dox可誘導(dǎo)uPA在Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織特異性表達(dá)，且滲漏表達(dá)率極低，Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA/SCID小鼠經(jīng)Dox誘導(dǎo)后進(jìn)行了HepG2和Huh-7細(xì)胞脾內(nèi)移植。結(jié)果顯示，其有效嵌合度可達(dá)30%，小鼠死亡率低于5%。本研究成功建立了一種肝組織特異性可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并且以此為基礎(chǔ)建立了可誘導(dǎo)型uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型，為進(jìn)一步開展HCV感染研究以及抗病毒藥物評價奠定了基礎(chǔ)。 (2)可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于HBV轉(zhuǎn)染及HCV感染研究 本研究將可誘導(dǎo)Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于pAAV-HBV水動力轉(zhuǎn)染模型研究。結(jié)果顯示，與Dox未誘導(dǎo)小鼠相比，Dox誘導(dǎo)的Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)染pAAV-HBV后，HBV基因組在小鼠體內(nèi)復(fù)制表達(dá)明顯增加，小鼠肝臟炎性損傷顯著加重，血清中白介素-6及腫瘤壞死因子α顯著升高(p0.01)，肝組織病理損傷加重，AFP基因轉(zhuǎn)錄水平升高。相比于C57BL/6小鼠，可誘導(dǎo)Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠更適合HBV水動力轉(zhuǎn)染模型的建立，其應(yīng)用于uPA與HBV病毒復(fù)制及致病機(jī)制研究具有更顯著的優(yōu)勢。此外，本研究以可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步開展了HCV陽性血清感染研究。通過尾靜脈接種HCV陽性血清后， HCV蛋白和RNA檢測為陰性。其原因可能是HCV陽性血清感染滴度較低或小鼠種屬特異性等綜合因素所致，具體原因有待進(jìn)一步探索。相比于直接利用陽性血清接種感染，利用具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的載體介導(dǎo)HCV感染，其穩(wěn)定性和有效性或?qū)⑻岣��？烧T導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立，為進(jìn)一步開展HBV轉(zhuǎn)染及HCV感染研究奠定了基礎(chǔ)。 2.第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型及小鼠模型研究 現(xiàn)有的人肝嵌合小鼠模型屬于免疫缺陷型小鼠，不能有效應(yīng)用于肝炎病毒感染致病、免疫感染機(jī)制及疫苗研究和評價等方面。因此，建立非免疫缺陷型（即正常免疫狀態(tài)）的可用于HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評價的小鼠模型，已成為HCV模型研究新的重要方向。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或病毒載體介導(dǎo)病毒基因組建立相應(yīng)的動物模型是值得探索研究的新的技術(shù)途徑。為了建立具有正常免疫狀態(tài)的HCV小鼠模型，本研究采用輔助病毒依賴型腺病毒(HDAd,helper-dependent adenovirus)載體介導(dǎo)HCV全基因組，探索建立制模簡便而模型穩(wěn)定的HCV新型細(xì)胞模型和小鼠模型。HDAd是第三代腺病毒載體，又稱空殼載體，由于去除了腺病毒全部的編碼反式作用蛋白的基因（功能由輔助病毒提供），僅保留了兩端反向末端重復(fù)序列(ITRs, inverted terminal repeats)以及包裝信號(Ψ)，因而其包裝容量高達(dá)37kb，可用于HCV全基因組的包裝；而目前常用的其他病毒載體因包裝容量限制，無法用于HCV約10kb全基因組的包裝及遞送。HDAd具有高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、低毒性以及肝組織嗜性等優(yōu)點(diǎn)，也使其非常適合HCV全基因組呈遞。本研究首次利用HDAd包裝HCV全基因組，進(jìn)行HCV全基因組細(xì)胞模型以及小鼠模型的建立和評價研究，以期為HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評價提供一個新的技術(shù)手段。 (1)第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型 雖然近年來，HCV感染性細(xì)胞模型取得一定進(jìn)展，以Huh-7細(xì)胞及其衍生細(xì)胞系為基礎(chǔ)，先后建立了HCV2a型JFH1全基因組體外轉(zhuǎn)錄RNA瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型以及JFH1基因組cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，以上兩種轉(zhuǎn)染模型均能支持HCV的有效復(fù)制及病毒產(chǎn)生，但轉(zhuǎn)染性細(xì)胞模型對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的狀態(tài)和轉(zhuǎn)染條件要求較高，其可重復(fù)性及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。本研究采用HDAd介導(dǎo)HCV全基因組感染的一種新的技術(shù)途徑，探索建立操作簡便和模型穩(wěn)定的HCV感染細(xì)胞模型。首先在HCV2a型JFH1全基因組3’加入一個HDV核酶位點(diǎn)后將其連入HDAd載體中，通過輔助病毒AdNG163實(shí)現(xiàn)重組HDAdJFH1病毒的包裝、擴(kuò)增及梯度離心純化，得到較高滴度的重組HDAdJFH1病毒，進(jìn)而建立HDAd介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型。細(xì)胞免疫熒光、Western blot及Northern blot結(jié)果顯示，HDAd介導(dǎo)了HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA在Huh-7細(xì)胞中的有效表達(dá)。實(shí)時定量結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCV RNA水平最高可達(dá)1.8×107拷貝/ml。另外，上清再感染的細(xì)胞免疫熒光、抗體阻斷以及透射電鏡和免疫電鏡結(jié)果均表明，細(xì)胞及培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了感染性HCV病毒顆粒。實(shí)驗(yàn)研究表明，通過HDAd介導(dǎo)，我們建立了一種新型HCV感染性細(xì)胞模型，該模型可穩(wěn)定連續(xù)傳代，有效支持HCV復(fù)制及感染性HCV產(chǎn)生，HCV感染性滴度最高達(dá)1×103ffu/ml。同時該細(xì)胞模型也可用于α干擾素等抗病毒藥物評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，HDAd同樣能介導(dǎo)HCV1b型Con1全基因組感染性細(xì)胞模型的建立。這對建立不同基因型的HCV細(xì)胞模型和進(jìn)行相關(guān)抗病毒藥物評價等具有重要意義。 (2)第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組小鼠模型 HCV具有高度種屬特異性，僅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，目前尚無法實(shí)現(xiàn)HCV在非免疫缺陷型小鼠體內(nèi)復(fù)制和感染。本研究通過HDAd介導(dǎo)HCV全基因組小鼠模型的建立，通過輔助病毒AdNG163實(shí)現(xiàn)重組HDAdJFH1病毒的包裝、擴(kuò)增，經(jīng)梯度離心純化后，HDAdJFH1病毒滴度可達(dá)2×1011病毒顆粒數(shù)(viral particle, vp)/ml，將1×1010vp HDAdJFH1以及HDAdGFP病毒分別通過尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了由HDAd介導(dǎo)的HCV2a型JFH1全基因組小鼠模型。結(jié)果顯示該小鼠模型可支持HCV的表達(dá)和復(fù)制，肝組織中可檢測到HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA，血清中HCV RNA水平可持續(xù)至感染后第8周。利用建立的HCV小鼠模型對抗-HCV藥物miR-122拮抗劑進(jìn)行了抗病毒效果評價，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-122拮抗劑在小鼠模型體內(nèi)可有效抑制HCV的復(fù)制。該研究表明，建立的HDAd介導(dǎo)的HCV全基因組小鼠模型可應(yīng)用于HCV藥物研究和評價。這也為該模型在致病機(jī)制和疫苗評價等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.63;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭燕菊;王文;孫世惠;曾道炳;趙光宇;于虹;郭彥;譚文杰;盧實(shí)春;周育森;;免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型中的表達(dá)[J];病毒學(xué)報;2010年01期

本文編號：1597281