本文選題：神經(jīng)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：缺氧缺血性腦損傷　出處：《鄭州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是各種原因引起的腦缺氧和腦血流減少或中斷造成大腦水腫及繼發(fā)重構(gòu),持續(xù)的腦細(xì)胞丟失及腦室周圍和鄰近皮質(zhì)白質(zhì)囊泡化,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量丟失,引起相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙,是導(dǎo)致兒童腦性癱瘓的主要原因。近年來隨著新生兒搶救技術(shù)的提高,發(fā)病率逐漸增高。目前中重度HIBD預(yù)后不良,而目前的治療方法療效有限,尋找有效的細(xì)胞重建途徑,替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞,是治療HIBD的新的理念和途徑,神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)移植是最近研究的新的治療方法。NSCs是神經(jīng)細(xì)胞的天然前體細(xì)胞,是一類具有多分化潛能的未分化細(xì)胞,移植后在體內(nèi)能夠分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)細(xì)胞,從而發(fā)揮其替代損傷細(xì)胞修復(fù)損傷腦組織的作用。NSCs可以從哺乳動(dòng)物的胎腦、臍血、臍帶、骨髓、胎腦、胎盤羊膜細(xì)胞干細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生,然而因受多種因素限制,神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成功率不高,且移植后在宿主體內(nèi)的存活率尚低,因此,基因工程神經(jīng)干細(xì)胞就成為了神經(jīng)干細(xì)胞的主要來源。動(dòng)物和臨床研究實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)用定向分化的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦損傷、帕金森氏病、脫髓鞘疾病、老年性癡呆、腦梗塞以及惡性腦腫瘤、脊髓損傷、癲癇等起到了良好療效,為使用常規(guī)方法難以見效的神經(jīng)疾患治療提供了廣闊的思路和誘人的前景。新生動(dòng)物腦組織內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞,如何使這些神經(jīng)干細(xì)胞移植后到達(dá)治療區(qū),并定向分化為目的神經(jīng)細(xì)胞一直是科學(xué)家們致力研究的熱點(diǎn)。已有研究證明,神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化受多種因素的制約,包括基因、轉(zhuǎn)錄因子以及神經(jīng)干細(xì)胞所處的局部微環(huán)境,Foxg1基因便是這諸多因素之一。大量研究表明新生動(dòng)物HIBD后腦結(jié)構(gòu)與功能重建是胚胎期發(fā)育的再現(xiàn)和延續(xù),Foxg1基因在大腦發(fā)育過程中扮演著重要角色。Foxg1基因是目前已知的調(diào)控大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育的關(guān)鍵基因,其缺失將導(dǎo)致整個(gè)大腦半球發(fā)育不良。Foxg1基因在生后仍可持續(xù)表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞聚集區(qū)的室管膜下區(qū)及海馬等部位,在神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用。然而Foxg1調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制是什么?在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮著怎樣的作用,目前的研究尚無(wú)明確回答。國(guó)外的研究表明,Foxg1調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖可能與抑制p21基因的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞移植,觀察HIBD后新生大鼠腦組織海馬區(qū)(sub granular zone, SGZ) Foxg1與p21基因mRNA表達(dá)的變化,探討NSCs移植對(duì)二者的影響。為基因工程神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的 本實(shí)驗(yàn)旨在通過分離和培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞,定向誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化,通過尾靜脈途徑移植入HIBD新生大鼠體內(nèi),采用原位雜交法,分別于各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定HIBD及NSCs移植后SGZ區(qū)Foxg1基因與p21基因mRNA表達(dá)的變化水平,記錄二者變化趨勢(shì),探討HIBD及NSCs移植后海馬區(qū)二者表達(dá)變化的關(guān)系,從基因水平進(jìn)一步探討神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)制,對(duì)提高NSCs移植后在腦組織受損部位增殖與分化效率具有重要意義,為基因工程神經(jīng)干細(xì)胞在臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 收集健康足月產(chǎn)婦胎盤臍帶血,分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,采用細(xì)胞培養(yǎng)法,培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞,并定向誘導(dǎo)分化,利用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。以7日齡SD新生大鼠為研究對(duì)象,共150只,雌雄不限。采用隨機(jī)數(shù)字表法,將其隨機(jī)分為HIBD-NSCs移植組,HIBD組,假手術(shù)組,各組分別50只。采用經(jīng)典Rice法制作HIBD模型,模型制作后1d將培養(yǎng)的NSCs移植入HIBD大鼠體內(nèi),設(shè)模型制作成功后3d、7d、14d、21d、28d為觀察點(diǎn)。分別于各觀察點(diǎn)將大鼠處死,取右側(cè)半球腦組織,10%甲醛液固定,常規(guī)石蠟包埋固定,HE染色鑒定模型,以原位雜交法,測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)Foxgl mRNA與p21 mRNA在海馬區(qū)的表達(dá)變化,觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)二者表達(dá)的影響,探索二者的內(nèi)在聯(lián)系。 結(jié)果 1原代培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)的原代MSCs呈圓形,7天后呈短梭形,單個(gè)核,折光性較強(qiáng),后逐漸伸出突起,期間J混有破骨樣細(xì)胞,體積較大,呈圓形,多個(gè)核。28天左右細(xì)胞鋪滿瓶底。 2臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定 原代細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí),加入誘導(dǎo)劑hEGF, bFGF,誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。免疫細(xì)胞化學(xué)染色,觀察Nestin、NSE、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)后表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯增加。 3 HIBD動(dòng)物模型鑒定 常規(guī)HE染色檢查結(jié)果示：左側(cè)(結(jié)扎側(cè))出現(xiàn)顯著的病理變化,SGZ區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元壞死。 4原位雜交檢測(cè)結(jié)果： (1) Foxg1基因mRNA在假手術(shù)組SGZ區(qū)有表達(dá),在HIBD組和HIBD-NSCs移植組,于模型制作后第7天表達(dá)最高,此后逐漸下降。 (2)p21基因mRNA在假手術(shù)組SGZ區(qū)有表達(dá),在HIBD組和HIBD-NSCs移植組,于模型制作后第7天表達(dá)最低,此后逐漸上升。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果 Foxg1基因mRNA與p21基因mRNA的表達(dá)在HIBD組、HIBD-NSCs移植組及假手術(shù)組均呈負(fù)相關(guān)；在HIBD組,其二者的相關(guān)系數(shù)r值為-0.743;在假手術(shù)組,二者的相關(guān)系數(shù)為-0.891(P0.05),在HIBD-NSCs移植組,二者的相關(guān)系數(shù)為-0.841。 結(jié)論 1 Foxg1基因出生后仍可表達(dá)于腦組織SGz區(qū)。HIBD可改變體內(nèi)微環(huán)境從而使Foxg1mRNA表達(dá)上升,促進(jìn)腦組織損傷后的結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。NSCs移植后,可改善HIBD后內(nèi)環(huán)境,啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞因子的表達(dá),促使Foxg1基因mRNA表達(dá)增加,從而抑制細(xì)胞凋亡。 2正常腦組織也可表達(dá)p21基因mRNA,正常腦組織也存在細(xì)胞的程序性死亡。HIBD可導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因p21基因mRNA的表達(dá)增加,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增加。 3 p21在腦組織海馬區(qū)的表達(dá)隨Foxg1基因表達(dá)的升高而降低,Foxg1基因可能是p21基因的上游調(diào)控基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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