本文選題：細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法　切入點(diǎn)：CD40　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究是目前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，這些研究有助于我們了解蛋白質(zhì)功能，以及闡明信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而揭示生命的奧秘。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，我們目前擁有了不少研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)方法，但是面對如此復(fù)雜而又精密的生命體系，這些技術(shù)所能解決的問題還很局限，其中如何研究蛋白質(zhì)動態(tài)的相互作用就是核心問題之一。同靜態(tài)的相互作用相比，蛋白質(zhì)之間的解離、聚合、再解離、再聚合，更吸引著生物學(xué)家的目光，因?yàn)檫@往往意味著某條信號通路的激活或抑制，而這些信號通路通常又是引起細(xì)胞生長、分化、突變、衰老、死亡等復(fù)雜生理或病理變化的始動因素。 腫瘤壞死因子受體超家族中的許多成員在免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，其中CD40是I型由免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的膜蛋白，是由激活的T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白CD154的受體，它是MAPK、NFκB通路及非經(jīng)典NFκB通路的重要激活子。其介導(dǎo)的信號通路不僅對免疫應(yīng)答至關(guān)重要，而且與自身免疫性疾病，神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。因此，深入理解CD40信號通路的分子機(jī)制以逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)之一。 目前的研究揭示CD40受體激活的過程顯示：CD40首先招募直接與其相互作用的TNF受體相關(guān)因子TRAFs（TNF receptor associate factor），并由TRAFs作為adaptor招募下游信號激活關(guān)鍵分子如NFκB和應(yīng)激激活蛋白激酶等，形成受體復(fù)合體；再通過受體復(fù)合體中的部分分子激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)。但是，CD40在抗原呈遞細(xì)胞中的傳導(dǎo)激活信號機(jī)制并不是完全清楚，因此，研究CD40信號復(fù)合體的組成及功能將有助于闡明CD40引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制，而CD40信號激活狀態(tài)下的動態(tài)蛋白質(zhì)復(fù)合物組成也將成為CD40信號通路研究的前沿 本研究利用最新蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，研究細(xì)胞表面受體CD40激活后細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，初步建立一套可用來分析蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的技術(shù)體系，并在CD40信號激活過程中，研究尋找CD40受體復(fù)合物的動態(tài)新組成。 蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究方法主要包括酵母雙雜交、蛋白芯片，串聯(lián)親和純化結(jié)合質(zhì)譜法以及基于生物信息學(xué)的分析等。近年來，基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展日新月異，又為生物學(xué)家研究蛋白質(zhì)相互作用提供了一種新的技術(shù)手段。基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于相互作用的研究原理是用親和純化的方式富集對照和實(shí)驗(yàn)組蛋白復(fù)合體，其中，背景蛋白和非特異結(jié)合是等量存在的，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組信號通路激活時(shí)，實(shí)驗(yàn)組結(jié)合的特異蛋白質(zhì)的量與對照組相比會發(fā)生變化（上調(diào)或者下調(diào)）。從而可以排除背景和非特異結(jié)合蛋白，識別與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的特異性結(jié)合蛋白。 這種基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括穩(wěn)定同位素標(biāo)記和非標(biāo)記的定量分析方法，其中，基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法常用的又分為兩類：一類是體外化學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量分析，包括同量異構(gòu)標(biāo)記的相對和絕對蛋白定量技術(shù)（Isobaric Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation, iTRAQ）和同位素親和標(biāo)簽（Isotope-Coded Affinity Tagging ,ICAT）等，另一類是穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量分析方法，如細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法（StableIsotope Labeling of Amino acids in Cell Culture,SILAC）。 SILAC技術(shù)由于標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、變異系數(shù)小和定量結(jié)果準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)成為一種分析動態(tài)相互作用結(jié)合蛋白的最有效的方法。其基本原理是分別利用天然和重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞，對細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)5-6個倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中。輕、重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合后，按蛋白質(zhì)組學(xué)方法制樣后，用質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量分析。SILAC技術(shù)用于解析蛋白質(zhì)相互作用，可以克服傳統(tǒng)研究方法（如酵母雙雜交、蛋白芯片等）的局限，它可以研究內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用，能有效區(qū)別背景與真實(shí)的相互作用蛋白質(zhì)，找出動態(tài)結(jié)合蛋白質(zhì)，檢測弱的或不穩(wěn)定的相互作用蛋白質(zhì)，并能大規(guī)模的實(shí)時(shí)分析蛋白相互作用的動態(tài)變化。 本研究根據(jù)配體激活CD40激活點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，選擇研究CD40配體刺激10分鐘的動態(tài)相互作用蛋白，實(shí)驗(yàn)選用了傳統(tǒng)的SILAC實(shí)驗(yàn)步驟即PAM（Purification afterMixing）和改進(jìn)的SILAC實(shí)驗(yàn)步驟MAP（Mixing after Purification）來完成實(shí)驗(yàn)，在三次試驗(yàn)中共鑒定出2130個蛋白質(zhì)，其中310個經(jīng)軟件分析得到定量信息，234個蛋白質(zhì)在三次實(shí)驗(yàn)中均被鑒定出來。配基刺激A20細(xì)胞10分鐘后上調(diào)蛋白質(zhì)（RATIO1.3%）51個，，下調(diào)蛋白質(zhì)（RATIO0.7%）14個，在鑒定的蛋白中找到了一些可能參與CD40信號通路的蛋白，其中與泛素蛋白酶體通路相關(guān)的有OTUB1、NEDD4，UBR2等；與通路相關(guān)的激酶，如MAPKK3和Dual specificitytyrosine phosphorylation regulated kinase 1；與NFκB信號通路相關(guān)的蛋白有NFκBp100，NFκB activator 1，Myb binding protein 1，Sequestosome 1等，還有一些具有其他重要功能蛋白有NEDD1，ADPATPtransfor 1，Non POU domaincontaining octamer binding protein等，現(xiàn)在我們正在對上述蛋白進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證以及功能探索，通過Westen blot我們已經(jīng)驗(yàn)證了NEDD4與CD40的相互作用，為CD40信號通路的調(diào)控及其機(jī)制的研究提供了十分重要的線索。 本研究建立了用SILAC定量技術(shù)體系研究細(xì)胞內(nèi)CD40激活后蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)變化。不僅為CD40信號通路的研究提供了重要的線索，更為重要的是我們初步搭建了一個研究蛋白質(zhì)復(fù)合物動態(tài)變化的技術(shù)平臺，為其它重要信號通路的研究提供了一個可選的技術(shù)手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：1593309