本文選題：軟骨調(diào)節(jié)素-Ⅰ　切入點(diǎn)：MSCs　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并驗(yàn)證其在MSCs中的上調(diào)表達(dá),建立ChM-Ⅰ穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)的MSCs細(xì)胞株,為進(jìn)一步開展ChM-Ⅰ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化,構(gòu)建組織工程軟骨相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。 方法: 1.用Trizol法提取大鼠軟骨組織總RNA,根據(jù)ChM-Ⅰ基因序列(序列號(hào):AF051425)設(shè)計(jì)特異引物,上游引物為:5' GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA 3' ,下游引物為:5' GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG 3',通過PCR獲取ChM-Ⅰ目的基因,分別將ChM-Ⅰ目的基因的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒雙酶切,并將兩者定向連接,構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,挑取陽性單克隆并擴(kuò)增,酶切鑒定陽性克隆,并對(duì)插入的ChM-Ⅰ片段進(jìn)行測(cè)序。 2.密度梯度離心法獲得大鼠MSCs,傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原;對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),檢測(cè)所獲得MSCs的潛在分化能力。 3.脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠MSCs。實(shí)驗(yàn)分三組:實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒);對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒);空白組。通過預(yù)實(shí)驗(yàn),確定大鼠MSCs的最佳G418篩選濃度為200ug/ml。轉(zhuǎn)染復(fù)合體作用6小時(shí)后,更換完全培養(yǎng)基,48小時(shí)后加入200ug/mlG418篩選培養(yǎng)基,使用篩選培養(yǎng)基持續(xù)傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞,以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的大鼠MSCs。 4.取穩(wěn)轉(zhuǎn)后連續(xù)培養(yǎng)三代的大鼠MSCs提取總RNA和蛋白質(zhì),使用RT-PCR和Western blot分別在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)ChM-Ⅰ在各組大鼠MSCs細(xì)胞株內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),鑒定所篩選的大鼠MSCs細(xì)胞株中ChM-Ⅰ的上調(diào)表達(dá)及其穩(wěn)定性。 結(jié)果: 1.對(duì)陽性克隆鑒定及測(cè)序和序列分析對(duì)比,結(jié)果顯示與ChM-Ⅰ基因長(zhǎng)度相符,序列無誤,且讀碼框正確。 2.單細(xì)胞懸液接種48小時(shí)后換液,倒置顯微鏡觀察并拍照,可于培養(yǎng)皿底部見到呈梭形或三角形的貼壁細(xì)胞,培養(yǎng)11-13天后培養(yǎng)皿底部細(xì)胞密度達(dá)到90%以上。細(xì)胞傳代,在6小時(shí)內(nèi)可達(dá)80%以上貼壁,細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快,可見細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng),折光性較強(qiáng),可呈魚群樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果:MSCs陽性表面抗原CD90、CD29的表達(dá)率分別為99.79%、98.41%;MSCs陰性表面抗原CD45、CD11b/c的表達(dá)率分別為2.77%、2.51%。成脂誘導(dǎo)2周后,油紅O染色,脂滴為橙紅色;成骨誘導(dǎo)3周后,茜素紅染色,鏡下顯現(xiàn)為紅色斑片。 3.轉(zhuǎn)染復(fù)合體作用6小時(shí)后,可見大量MSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)折光性強(qiáng)的小泡,提示陽離子脂質(zhì)體已結(jié)合質(zhì)粒進(jìn)入MSCs。48小時(shí)后加入200ug/mlG418篩選培養(yǎng)基5天后空白組出現(xiàn)少量細(xì)胞漂浮死亡,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組也可見少量細(xì)胞死亡。7天后空白組出現(xiàn)大量死亡,14天后空白組細(xì)胞全部死亡,兩個(gè)轉(zhuǎn)染組大約有10%的細(xì)胞存活,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不再死亡,開始增殖,生長(zhǎng)速度逐漸加快。傳代后,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,排列密集整齊,呈編織狀旋渦狀。 4. RT-PCR結(jié)果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作為評(píng)定指標(biāo),實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分別為1.0817±0.2233、0.3601±0.1260、0.3687±0.0086;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,對(duì)照組與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P 0.05。Western blot結(jié)果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作為評(píng)定指標(biāo),實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分別為0.9867±0.0204、0.4155±0.0206、0.3751±0.0081;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),對(duì)照組與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。結(jié)果提示:實(shí)驗(yàn)組中的ChM-Ⅰ在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和空白組。 結(jié)論: 成功將pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,經(jīng)過含G418的篩選培養(yǎng)基穩(wěn)定篩選,最終建立ChM-Ⅰ穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)的MSCs細(xì)胞株,為進(jìn)一步開展ChM-Ⅰ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化,構(gòu)建組織工程軟骨相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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5 楊s，

本文編號(hào)：1588654