本文選題：肝X受體　切入點(diǎn)：枯否細(xì)胞　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:通過體外細(xì)胞試驗(yàn),探討肝X受體-α(LXRα)抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠枯否細(xì)胞(KCs),炎癥反應(yīng)途徑與神經(jīng)元衍生孤核受體-1(NOR-1)的關(guān)系。 方法:用密度梯度離心法分離雄性KM小鼠肝臟中的KCs,并將獲得的細(xì)胞用含20% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后隨機(jī)分為四組:(1)對照組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)30h。(2)LPS處理組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)24h,再以含10μg/ml LPS的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。(3)T0901317組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)6h后,再以T0901317終濃度為1μM的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。(4)LPS+T0901317組:以T0901317終濃度為1μM的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,再用含10μg/ml LPS的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。實(shí)時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測各組細(xì)胞的LXRα和NOR-1的mRNA表達(dá)水平;Western blotting及免疫細(xì)胞熒光染色檢測各組細(xì)胞的LXRα和NOR-1的蛋白表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組上清液的TNF-α和IL-10含量。 結(jié)果:(1)Real-Time PCR結(jié)果顯示:LXRαmRNA在聯(lián)合處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2~(-△△CT)2,結(jié)果有顯著性差異;LXRαmRNA在T0901317處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT2,結(jié)果有顯著性差異;其在空白組中的表達(dá)量高于LPS處理組,其2~(-△△CT)2,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NOR-1 mRNA在聯(lián)合處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2~(-△△CT)2,結(jié)果有顯著性差異;NOR-1 mRNA在T0901317處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2~(-△△CT)2,結(jié)果有顯著性差異;其在空白組中的表達(dá)量高于LPS處理組,其2~(-△△CT)2,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)Western blot檢測結(jié)果顯示:LXRα及NOR-1蛋白為單一條帶,其相對分子質(zhì)量分別為50kDa、60kDa,用內(nèi)參照對待測物灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。LPS組LXRα和NOR-1表達(dá)最低(其值分別為0.569±0.046和0.335±0.042),明顯低于其它三組(對照組分別為:1.014±0.050和0.541±0.017,聯(lián)合處理組分別為:1.232±0.027和0.819±0.022,T0901317處理組分別為:1.736±0.039和1.031±0.040),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與其它三組相比,LXRα和NOR-1蛋白表達(dá)都在T0901317處理組最高(P0.05);LPS處理組中,LXRα及NOR-1蛋白表達(dá)都低于對照組(P0.05)。(3)免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示:LXRα陽性細(xì)胞為胞漿及胞核內(nèi)綠色熒光顆粒,NOR-1陽性細(xì)胞為胞漿及胞核內(nèi)紅色熒光顆粒。LXRα熒光染色強(qiáng)度在對照組、T0901317處理組、LPS處理組及聯(lián)合處理組分別為(97.52±10.39; 110.04±14.54; 56.98±7.95; 105.58±14.03);NOR-1染色強(qiáng)度在對照組、T0901317處理組、LPS處理組及聯(lián)合處理組分別為(80.15±4.88; 115.65±8.47; 65.50±5.76; 94.14±4.48 ),表示其蛋白表達(dá)水平在 T0901317組最高(P0.05),在LPS處理組最低(P0.05)。此結(jié)果與western結(jié)果相符。(4)ELISA結(jié)果顯示:腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)在LPS處理組的含量(450.89±78.52)顯著高于對照組(5.84±2.35)及T0901317處理組(6.73±1.90),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);聯(lián)合處理組TNF-α含量(61.21±17.45)比LPS處理組明顯降低(P0.05)。白介素-10(Interleukin-10, IL-10)在聯(lián)合處理組的含量(537.41±36.41)顯著高于對照組(10.67±3.48)及T0901317處理組(10.17±1.82),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);聯(lián)合處理組IL-10含量比LPS處理組(61.85±12.41)明顯提高(P0.05)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用T0901317處理后,LXRα和NOR-1的表達(dá)都明顯增加,LPS所誘生的炎癥因子TNF-α大大降低,而抑炎因子IL-10含量大大增加。相對于對照組及T0901317處理組,在經(jīng)過LPS處理后,LXRα和NOR-1的表達(dá)都有降低,TNF-α表達(dá)明顯上升,IL-10表達(dá)明顯下降。因此,LXRα與NOR-1存在著相互依賴的關(guān)系,LXRα能夠通過調(diào)節(jié)NOR-1的表達(dá)而發(fā)揮抗炎效應(yīng),從而抑制LPS所誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞活化。
[Abstract]:Objective: To investigate the inhibitory effect of liver X receptor alpha (LXR alpha) on lipopolysaccharide (LPS) induced Kupffer cells (KCs) and the relationship between inflammatory response pathway and neuronal derived nuclear receptor -1 (NOR-1) in vitro.
Methods: isolated from male KM mice by KCs density gradient centrifugation, and the cells obtained with 20% FCS RPMI1640 medium after 24h were randomly divided into four groups: (1) control group: Cultured in RPMI1640 30h. (2) LPS group: Cultured in RPMI1640 24h, then with 10 g/ml LPS serum-free medium for 6h. (3) T0901317 group: Cultured in RPMI1640 after 6h, then to T0901317 final concentration of serum-free medium for 24h. 1 M (4) LPS+T0901317 group: T0901317 to a final concentration of 1 M without serum cultured 24h, serum-free medium 6h. real-time fluorescence quantitative PCR with 10 g/ml LPS (Real-Time PCR) to detect the expression of LXR alpha and NOR-1 mRNA expression; the expression level of Western and blotting were assayed by immunofluorescence staining of LXR alpha and NOR-1 protein; ELISA The content of TNF- alpha and IL-10 in the supernatant of each group was detected by the method.
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本文編號：1576412