本文選題：SELEX（指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）　切入點(diǎn)：鮑曼不動桿菌　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【目的】 用SELEX技術(shù)，以鮑曼不動桿菌作為復(fù)合靶物質(zhì)，在體外合成長度為88個nt的隨機(jī)寡核苷酸文庫中，篩選出與鮑曼不動桿菌具有高親和力高特異性的適配子，再以環(huán)氧乙烷丙烯酸珠子作為篩選介質(zhì)，利用生物素-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)檢測DNA適配子與鮑曼不動桿菌的親和力，以獲得能夠結(jié)合鮑曼不動桿菌的高親和力適配子。 【方法】 1.在體外構(gòu)建總長度88nt，中間隨機(jī)序列為42nt，兩端為固定序列的寡核苷酸文，以滅活的鮑曼不動桿菌為靶分子，經(jīng)過15輪 吸附－漂洗－洗脫－擴(kuò)增‖的SELEX篩選，篩選出針對鮑曼不動桿菌高親和力高特異性的適配子，用生物素-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)利進(jìn)行ssDNA富集庫與鮑曼不動桿菌的結(jié)合力測定。 2.在第12輪、第13輪，第14輪和第15輪分別同時進(jìn)行ssDNA文庫與洛菲不動桿菌和溶血不動桿菌進(jìn)行反篩，運(yùn)用生物素-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)來比較經(jīng)過反篩和未經(jīng)過反篩獲得的ssDNA富集庫與鮑曼不動桿菌的結(jié)合力。 3.將第9輪和第12輪、第15輪篩選得到的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、純化， TA克隆、測序后并用相關(guān)軟件分析其一級機(jī)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)。篩選得到的產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后在聚丙烯酞胺凝膠電泳圖中顯示，伴隨著篩選輪數(shù)的遞增，PCR擴(kuò)增電泳條帶逐漸單一純化。 4.利用生物素-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)進(jìn)行鮑曼不動桿菌與適配子的結(jié)合力測定，選出OD值較高的3個適配子，測定其親和力；對親和力最高的克隆適配子，做進(jìn)一步的特異性與靈敏度分析。我們還運(yùn)用DFA（dot filtration assay，DFA）對B20適配子與同菌屬其他不動桿菌進(jìn)行反篩選做特異性檢測。 【結(jié)果】 1.隨著篩選輪數(shù)的增加，鮑曼不動桿菌與ssDNA富集庫結(jié)合的OD值不斷的增加， 2.在第12輪反篩選得到的富集庫與鮑曼不動桿菌結(jié)合后顯色的OD值（0.469）是第一輪OD值（0.023）的20.39倍。從13輪、14輪、15輪的OD值可以看出，當(dāng)ssDNA富集庫與鮑曼不動桿菌的結(jié)合位點(diǎn)逐漸趨于飽和后，吸附到鮑曼不動桿菌上的ssDNA就不再增加。 2.在第11輪篩選時，出現(xiàn)了O.D值降低，這可能是由于篩選壓(選擇/進(jìn)化壓)的影響，從而使我們所期望得到的寡核昔酸片段出現(xiàn)非特異性的增強(qiáng)。 3.比較經(jīng)過反篩與未經(jīng)過未反篩的ssDNA富集庫與鮑曼不動桿菌結(jié)合的OD值，發(fā)現(xiàn)有明顯的差異，最低的第15輪的反篩和未反篩的OD比值為1.7倍，到最高的第12輪比值的40倍。 4.克隆測序結(jié)果表明，第9輪、第12輪和第15輪未反篩的序列均未出現(xiàn)富集，而對第15輪反篩的克隆子進(jìn)行測序，則發(fā)現(xiàn)在23個預(yù)期的隨機(jī)序列中，有3條序列富集,相似度極高(B20、B35和B44)，，同源性分析高達(dá)92%。我們利用DNASTAR軟件對序列的一級結(jié)構(gòu)同源性做比較，可將分成9個家族(Family)，再利用DNASISV2.5軟件分別進(jìn)行計算。其中有個別序列與任何一個家族均無關(guān)系。 5.克隆適配子B20、B35和B44與鮑曼不動桿菌結(jié)合的OD值明顯增高；進(jìn)行親和力測定，可知：B20的Kd為17.89nM，B35為86.83nM，B44為103.99nM；通過適配子B20靈敏度的結(jié)合測定，可知細(xì)菌數(shù)最低可至2.5×106。 【結(jié)論】 本研究運(yùn)用SELEX技術(shù)，并利用該菌屬其他不動桿菌進(jìn)行反篩，經(jīng)15輪篩選，得到針對鮑曼不動桿菌的ssDNA適配子，通過運(yùn)用生物素-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)和DFA技術(shù)對已篩選得到的適配子進(jìn)行特異性、靈敏度和親和力的分析，已成功篩選到親和力高、特異性強(qiáng)的鮑曼不動桿菌適配子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 李衛(wèi)濱;蘭小鵬;楊湘越;吳文冰;;SELEX技術(shù)在篩選環(huán)孢霉素A適體中的運(yùn)用[J];福州總醫(yī)院學(xué)報;2007年03期

2 陳棟;黃慶;黃君富;府偉靈;;適配子及其臨床診斷的應(yīng)用進(jìn)展[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

3 王雷;李元躍;陳融斌;黎中寶;;運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選嗜水氣單胞菌適配子[J];集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年01期

4 張慶麗;李海濤;趙世源;劉榮梅;趙勇;高繼國;;蘇云金芽胞桿菌cry1Ib6基因的克隆、表達(dá)及活性的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報;2011年06期

5 詹林盛,卓海龍,王會中,彭劍淳,王全立;丙型肝炎病毒NS3螺旋酶寡核苷酸適配子的篩選與鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2005年03期

6 曾燕麗;蘭小鵬;江麗;劉豐偉;李衛(wèi)濱;;滅活銅綠假單胞菌適體的篩選[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2009年01期

本文編號：1568102