本文選題：氣管黏膜上皮細(xì)胞　切入點：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《揚州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 探討兔氣管黏膜上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)和鑒定方法。 一、建立氣管黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,探討其體外生長與傳代的規(guī)律。 二、體外構(gòu)建氣管黏膜上皮細(xì)胞片。 三、體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并對其進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化提供實驗方法和技術(shù)支持。 方法： 一、體外培養(yǎng)氣管黏膜上皮細(xì)胞 (1)通過組織塊法、兩步酶消化法獲得兔氣管黏膜上皮細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。 (2)將第3代兩種方法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞及凍存復(fù)蘇后的上皮細(xì)胞分別種植于96孔板內(nèi),于6、12、24、36、48、60、72小時取出,用MTT法測定細(xì)胞增殖活性。 (3)通過HE染色、掃描電子顯微鏡分別對培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,通過免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光分別對獲得的上皮細(xì)胞實施PCK、CK-18檢測,進(jìn)行鑒定。 二、體外構(gòu)建氣管黏膜上皮細(xì)胞片 采用組織塊法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞,利用溫敏培養(yǎng)皿制作上皮細(xì)胞片,并通過HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光染色、掃描電子顯微鏡對細(xì)胞片進(jìn)行鑒定。 三、體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 通過細(xì)胞密度梯度離心法、全血培養(yǎng)法獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原鑒定。 結(jié)果： 一、體外培養(yǎng)氣管黏膜上皮細(xì)胞 (1)通過組織塊法、兩步酶消化法可以獲得兔氣管黏膜上皮細(xì)胞,組織塊法對細(xì)胞傷害較小,雜化細(xì)胞較多,但可以通過細(xì)胞純化處理獲得較高純度的上皮細(xì)胞。機(jī)械刮除法等細(xì)胞純化方法有助于上皮細(xì)胞的進(jìn)一步純化。 (2)凍存三個月的細(xì)胞,復(fù)蘇后存活率、貼壁率較高,但生長增殖速度明顯不如未凍存細(xì)胞。 (3)HE染色可見細(xì)胞形態(tài)呈梭形、圓形、多角形等,細(xì)胞核深染,細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。 (4) SABC法染色檢測細(xì)胞中的角蛋白及上皮細(xì)胞特異性角蛋白,細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色；而對照組中細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)未見棕黃色,結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。 (5) FITC標(biāo)記的熒光抗體檢測細(xì)胞中的角蛋白及上皮細(xì)胞特異性角蛋白,可見細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài),同時細(xì)胞質(zhì)呈亮綠色；而對照組中可見細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài),但細(xì)胞質(zhì)未見亮綠色,結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。 (6)掃描電子顯微鏡檢測中明顯可見部分細(xì)胞有纖毛,表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。 二、上皮細(xì)胞片的制作 (1)采用組織塊法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞,種植到溫敏培養(yǎng)皿上。約10-14天,細(xì)胞基本長滿皿底。換液后隔天可以收獲細(xì)胞片。 (2)HE染色可見細(xì)胞片中細(xì)胞密集排列,細(xì)胞核深染,細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。 (3) SABC法染色檢測細(xì)胞片中的角蛋白及上皮細(xì)胞特異性角蛋白,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核淡藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)棕黃色,而對照組中細(xì)胞密集排列,細(xì)胞核深染,細(xì)胞質(zhì)未見棕黃色,結(jié)果表明利用純化后的上皮細(xì)胞制作的細(xì)胞片為上皮細(xì)胞片。 (4) FITC標(biāo)記的熒光抗體檢測細(xì)胞片中的角蛋白及上皮細(xì)胞特異性角蛋白,細(xì)胞排列密集,可見細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài),細(xì)胞質(zhì)呈亮綠色,而對照組中細(xì)胞密集排列,細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)可見,但細(xì)胞質(zhì)未呈亮綠色,結(jié)果表明構(gòu)建的細(xì)胞片為上皮細(xì)胞片。 (5)掃描電子顯微鏡檢測中可見細(xì)胞密集排列,部分細(xì)胞中可見纖毛,結(jié)果表明構(gòu)建的細(xì)胞片為上皮細(xì)胞片。 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) (1)全血培養(yǎng)法和細(xì)胞密度梯度離心法均可以獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞呈梭形、圓形、不規(guī)則形等。 (2)采用流式細(xì)胞檢測技術(shù),鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原,CD29、CD44高表達(dá),不表達(dá)CD14、CD34。 結(jié)論： 1、應(yīng)用組織塊法和消化法成功構(gòu)建了氣管黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型。 2、利用溫敏培養(yǎng)皿在體外成功構(gòu)建了氣管黏膜上皮細(xì)胞片。 3、體外成功分離、培養(yǎng)出兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞表面抗原鑒定,為進(jìn)一步研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。
[Abstract]:Objective:
The culture techniques and identification methods of rabbit tracheal epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells were studied in vitro.
First, the culture model of tracheal epithelial cells in vitro was established, and the laws of its growth and passage in vitro were discussed.
Two, the epithelial cells of the tracheal mucosa were constructed in vitro.
Three, in vitro culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells, and provide experimental methods and technical support for further research on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epithelial cells.
Method錛，

本文編號：1567468