本文選題：人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子　切入點(diǎn)：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《暨南大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 1.克隆、表達(dá)、純化重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-α(rhSCGF-α)。 2.構(gòu)建并純化人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-α穿膜肽(TAT-SCGF)。 3.研究rhSCGF-α及TAT-SCGF對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)的增殖作用。 4.研究rhSCGF-α對(duì)hUCMSCs成脂分化的影響。 方法： 1.針對(duì)SCGF基因的高GC含量,采用PCR兩步法獲得hSCGF-α基因,插入入pET-28a(+)載體質(zhì)粒,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-SCGF-α,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得表達(dá)菌株。低溫20℃誘導(dǎo)24 h表達(dá),通過(guò)Ni2+-NTA柱純化,獲得目標(biāo)重組蛋白。以巨噬細(xì)胞/粒細(xì)胞(granulocyte/macrophage, GM)集落形成實(shí)驗(yàn)鑒定重組蛋白的生物學(xué)活性。MTT法檢測(cè)rhSCGF-α對(duì)hUCMSCs的增殖作用,并比較與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的差別。 2.采用基因工程技術(shù)將hSCGF-α基因重組插入pET-28a(+)質(zhì)粒DNA,構(gòu)建TAT-SCGF-28a重組DNA,并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),利用包涵體純化得到的hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF)研究其對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖刺激作用。 3.在hUCMSCs成脂分化過(guò)程中加入rhSCGF-α,利用Westernblot、Realtime PCR技術(shù),通過(guò)檢測(cè)成脂分化的標(biāo)志基因GPD、PPARγ2來(lái)研究rhSCGF-α對(duì)hUCMSCs成脂分化的影響。 結(jié)果： 1.PCR兩步法獲得hSCGF-α基因,成功構(gòu)建pET-28a-SCGF-α重組質(zhì)粒,目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中部分可溶性表達(dá)。純化出的rhSCGF-α單獨(dú)作用于小鼠GM不形成集落,但協(xié)同rmGM-CSF具有集落形成能力,并且集落數(shù)目具有濃度依賴(lài)性。rhSCGF-α對(duì)hUCMSCs作用的增殖率為(10.61±1.09)%,標(biāo)準(zhǔn)品為(10.18±0.96)%。 2.成功構(gòu)建了穿膜肽重組質(zhì)粒TAT-SCGF-28a,并在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式表達(dá)。純化得到的TAT-SCGF對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力為(12.95±1.37)%。 3. rhSCGF-α(0.31 ng/ml)對(duì)hUCMSCs的成脂分化促進(jìn)作用在第3 d即可檢測(cè)到。 結(jié)論： 1.利用基因工程技術(shù)得到的rhSCGF-α、TAT-SCGF均具有生物學(xué)活性；rhSCGF-α與標(biāo)準(zhǔn)品活性比較無(wú)顯著性差異。 2. rhSCGF-α、TAT-SCGF對(duì)hUCMSCs均具有增殖能力。 3. rhSCGF-α(0.31 ng/ml)對(duì)hUCMSCs成脂分化具有促進(jìn)作用。
[Abstract]:Objective:. 1. Cloning, expression and purification of recombinant human stem cell growth factor- 偽 (rhSCGF- 偽). 2. To construct and purify human stem cell growth factor- 偽 transmembrane peptide (TAT-SCGFG). 3. To study the effect of rhSCGF- 偽 and TAT-SCGF on the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCS). 4. To study the effect of rhSCGF- 偽 on adipogenic differentiation of hUCMSCs. Methods:. 1. In view of the high GC content of SCGF gene, hSCGF- 偽 gene was obtained by PCR two-step method and inserted into pET-28a () vector plasmid. The recombinant plasmid pET-28a-SCGF- 偽 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21DE3. The expression of hSCGF- 偽 was induced at 20 鈩，

本文編號(hào)：1567121