本文選題：施萬細胞　切入點：β-1　出處：《南通大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的研究在炎癥因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)刺激下施萬細胞中β-1,4-半乳糖基轉移酶Ⅰ(β-1,4-Galactosyltransferase Ⅰ,β-1,4-GalT Ⅰ)的表達改變,探討其在TNF-α自分泌、細胞增殖及凋亡中的作用及其機制。 方法 1.為了研究β-1,4-GalT Ⅰ在施萬細胞TNF-α自分泌中的作用,運用50ng/mL重組的大鼠TNF-α刺激體外培養(yǎng)及純化的大鼠施萬細胞,運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測施萬細胞TNF-α自分泌的改變,逆轉錄-多聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot檢測TNF-α誘導β-1,4-GalT Ⅰ的表達及細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)和p38信號轉導通路的激活情況,同時用中和性抗體阻斷TNFR1/2的功能,檢測其對TNF-α誘導的β-1,4-GalT Ⅰ表達及TNF-α自分泌的影響；在此基礎上在施萬細胞中分別轉染β-1,4-GalT Ⅰ干擾及過表達質粒,分析干預β-1,4-GalT Ⅰ的表達對施萬細胞ERK、JNK和p38信號轉導通路激活及其介導的TNF-α自分泌的影響。 2.為了探討β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α誘導的施萬細胞增殖及凋亡中的作用,運用不同溶度(0、0.001、0.01、0.1、1、10及100ng/mL)的重組大鼠TNF-α處理施萬細胞,運用MTT分析法,分析施萬細胞增殖的情況,運用TUNEL分析法,分析施萬細胞凋亡的情況,利用Western blot,檢測不同溶度TNF-α誘導β-1,4-GalT Ⅰ及TNFR1/2的表達變化。在此基礎上,利用基因轉染方法增加或減少β-1,4-GalT Ⅰ在施萬細胞中的表達,檢測ERK1/2、p38與JNK活性及施萬細胞增殖和凋亡的改變：同時運用中和抗體干預TNFR1/2的功能,分析介導上述效應的改變。 結果 1.施萬細胞在50ng/mL重組的大鼠TNF-α刺激24h后,細胞內TNF-α的mRNA水平及培養(yǎng)基中自分泌的TNF-α含量較未處理組明顯升高,RT-PCR及Western blot發(fā)現(xiàn)胞內β-1,4-GalT Ⅰ的mRNA及蛋白表達水平顯著增加。干擾施萬細胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表達,TNF-α的自分泌較未干擾組顯著降低,而過表達β-1,4-GalT Ⅰ后,施萬細胞內TNF-α的自分泌顯著提高。運用中和抗體阻斷TNFR的功能,發(fā)現(xiàn)阻斷TNFR1可以逆轉TNF-α誘導的β-1,4-GalT Ⅰ的表達及TNF-α的自分泌。Western blot顯示,TNF-α可以誘導ERK、JNK和p38信號通路的活化,抑制ERK、JNK和p38可以有效地抑制TNF-α的自分泌。干擾β-1,4-GalT Ⅰ的表達可以抑制TNF-α誘導的ERK、JNK和p38信號通路的活化,而過表達β-1,4-GalTⅠ后,TNF-α自分泌顯著增加,但可以被ERK、JNK和p38的抑制劑PD98059、SP600125和SB202190所抑制。 2.MTT法測定細胞增殖表明用不同濃度的TNF-α處理施萬細胞12h后,在0.001ng/mL時細胞增殖率顯著升高,在100ng/mL時細胞增殖明顯抑制,蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的標志蛋白Caspase-3表達100ng/mL時顯著上調,表明不同濃度的TNF-α可以誘導施萬細胞的增殖或凋亡。Western blot顯示在給予不同溶度TNF-α處理后,施萬細胞內0-1,4-GalTⅠ及TNFR1/2的表達發(fā)生改變。在β-1,4-GalT Ⅰ過表達的施萬細胞中給予低濃度TNF-α處理,PCNA蛋白水平表達的改變及細胞增殖分析發(fā)現(xiàn)過表達β-1,4-GalT Ⅰ可以逆轉TNF-α誘導的施萬細胞的增殖。進一步分析發(fā)現(xiàn),在β-1,4-GalT Ⅰ過表達的施萬細胞中,TNF-α誘導的ERK1/2的激活被逆轉,并且阻斷TNFR2及ERK的抑制劑PD98059可以逆轉低濃度TNF-α誘導的施萬細胞的增殖。在干擾0-1,4-GalT Ⅰ表達的施萬細胞中給予高濃度TNF-α處理,Caspase-3蛋白表達水平的改變及TUNEL分析表明干擾β-1,4-GalT Ⅰ的表達可以逆轉高濃度TNF-α誘導的施萬細胞凋亡,并且在干擾β-1,4-GalT Ⅰ表達的施萬細胞中,觀察到TNF-α誘導的JNK和p38的活化被逆轉,阻斷TNFR1和JNK,p38的抑制劑SP600125、SB202190可以逆轉高濃度TNF-α誘導的施萬細胞的凋亡。 結論 1. TNF-α可誘導施萬細胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表達,而表達增加的β-1,4-GalT Ⅰ通過激活ERK、JNK、p38信號轉導通路和TNFR1促進TNF-α誘導的自分泌,提示β-1,4-GalT Ⅰ可能在TNF-α誘導的自分泌循環(huán)中發(fā)揮正向調控作用。 2.低濃度TNF-α促進施萬細胞增殖,高濃度TNF-α誘導施萬細胞凋亡。β-1,4-GalT Ⅰ通過ERK1/2激酶通路和TNFR2抑制低濃度TNF-α誘導的施萬細胞增殖,并且可以通過JNK、p38信號通路和TNFR1促進高濃度TNF-α誘導的施萬細胞凋亡。提示β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α誘導的施萬細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。
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【學位授予單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【共引文獻】

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