本文選題：施萬細(xì)胞　切入點(diǎn)：β-1　出處：《南通大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的研究在炎癥因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)刺激下施萬細(xì)胞中β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(β-1,4-Galactosyltransferase Ⅰ,β-1,4-GalT Ⅰ)的表達(dá)改變,探討其在TNF-α自分泌、細(xì)胞增殖及凋亡中的作用及其機(jī)制。 方法 1.為了研究β-1,4-GalT Ⅰ在施萬細(xì)胞TNF-α自分泌中的作用,運(yùn)用50ng/mL重組的大鼠TNF-α刺激體外培養(yǎng)及純化的大鼠施萬細(xì)胞,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測施萬細(xì)胞TNF-α自分泌的改變,逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot檢測TNF-α誘導(dǎo)β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)和p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況,同時(shí)用中和性抗體阻斷TNFR1/2的功能,檢測其對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的β-1,4-GalT Ⅰ表達(dá)及TNF-α自分泌的影響；在此基礎(chǔ)上在施萬細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染β-1,4-GalT Ⅰ干擾及過表達(dá)質(zhì)粒,分析干預(yù)β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá)對(duì)施萬細(xì)胞ERK、JNK和p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活及其介導(dǎo)的TNF-α自分泌的影響。 2.為了探討β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞增殖及凋亡中的作用,運(yùn)用不同溶度(0、0.001、0.01、0.1、1、10及100ng/mL)的重組大鼠TNF-α處理施萬細(xì)胞,運(yùn)用MTT分析法,分析施萬細(xì)胞增殖的情況,運(yùn)用TUNEL分析法,分析施萬細(xì)胞凋亡的情況,利用Western blot,檢測不同溶度TNF-α誘導(dǎo)β-1,4-GalT Ⅰ及TNFR1/2的表達(dá)變化。在此基礎(chǔ)上,利用基因轉(zhuǎn)染方法增加或減少β-1,4-GalT Ⅰ在施萬細(xì)胞中的表達(dá),檢測ERK1/2、p38與JNK活性及施萬細(xì)胞增殖和凋亡的改變：同時(shí)運(yùn)用中和抗體干預(yù)TNFR1/2的功能,分析介導(dǎo)上述效應(yīng)的改變。 結(jié)果 1.施萬細(xì)胞在50ng/mL重組的大鼠TNF-α刺激24h后,細(xì)胞內(nèi)TNF-α的mRNA水平及培養(yǎng)基中自分泌的TNF-α含量較未處理組明顯升高,RT-PCR及Western blot發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)β-1,4-GalT Ⅰ的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加。干擾施萬細(xì)胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá),TNF-α的自分泌較未干擾組顯著降低,而過表達(dá)β-1,4-GalT Ⅰ后,施萬細(xì)胞內(nèi)TNF-α的自分泌顯著提高。運(yùn)用中和抗體阻斷TNFR的功能,發(fā)現(xiàn)阻斷TNFR1可以逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá)及TNF-α的自分泌。Western blot顯示,TNF-α可以誘導(dǎo)ERK、JNK和p38信號(hào)通路的活化,抑制ERK、JNK和p38可以有效地抑制TNF-α的自分泌。干擾β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá)可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的ERK、JNK和p38信號(hào)通路的活化,而過表達(dá)β-1,4-GalTⅠ后,TNF-α自分泌顯著增加,但可以被ERK、JNK和p38的抑制劑PD98059、SP600125和SB202190所抑制。 2.MTT法測定細(xì)胞增殖表明用不同濃度的TNF-α處理施萬細(xì)胞12h后,在0.001ng/mL時(shí)細(xì)胞增殖率顯著升高,在100ng/mL時(shí)細(xì)胞增殖明顯抑制,蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白Caspase-3表達(dá)100ng/mL時(shí)顯著上調(diào),表明不同濃度的TNF-α可以誘導(dǎo)施萬細(xì)胞的增殖或凋亡。Western blot顯示在給予不同溶度TNF-α處理后,施萬細(xì)胞內(nèi)0-1,4-GalTⅠ及TNFR1/2的表達(dá)發(fā)生改變。在β-1,4-GalT Ⅰ過表達(dá)的施萬細(xì)胞中給予低濃度TNF-α處理,PCNA蛋白水平表達(dá)的改變及細(xì)胞增殖分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)β-1,4-GalT Ⅰ可以逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在β-1,4-GalT Ⅰ過表達(dá)的施萬細(xì)胞中,TNF-α誘導(dǎo)的ERK1/2的激活被逆轉(zhuǎn),并且阻斷TNFR2及ERK的抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)低濃度TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞的增殖。在干擾0-1,4-GalT Ⅰ表達(dá)的施萬細(xì)胞中給予高濃度TNF-α處理,Caspase-3蛋白表達(dá)水平的改變及TUNEL分析表明干擾β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)高濃度TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞凋亡,并且在干擾β-1,4-GalT Ⅰ表達(dá)的施萬細(xì)胞中,觀察到TNF-α誘導(dǎo)的JNK和p38的活化被逆轉(zhuǎn),阻斷TNFR1和JNK,p38的抑制劑SP600125、SB202190可以逆轉(zhuǎn)高濃度TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論 1. TNF-α可誘導(dǎo)施萬細(xì)胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表達(dá),而表達(dá)增加的β-1,4-GalT Ⅰ通過激活ERK、JNK、p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和TNFR1促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的自分泌,提示β-1,4-GalT Ⅰ可能在TNF-α誘導(dǎo)的自分泌循環(huán)中發(fā)揮正向調(diào)控作用。 2.低濃度TNF-α促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖,高濃度TNF-α誘導(dǎo)施萬細(xì)胞凋亡。β-1,4-GalT Ⅰ通過ERK1/2激酶通路和TNFR2抑制低濃度TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞增殖,并且可以通過JNK、p38信號(hào)通路和TNFR1促進(jìn)高濃度TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞凋亡。提示β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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