發(fā)布時間：2018-03-04 01:19

  本文選題：原代星形膠質(zhì)細(xì)胞　切入點(diǎn)：氧化應(yīng)激　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：氧化應(yīng)激在許多疾病的病因?qū)W中占有重要地位，，機(jī)體產(chǎn)生有效的反應(yīng)來對抗內(nèi)源性或外源性氧化劑帶來的一系列威脅，這對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和生存至關(guān)重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子核因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）在星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)神經(jīng)元、對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。Nrf2促進(jìn)含抗氧化反應(yīng)元件（ARE）啟動子序列的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括谷氨酸半胱氨酸連接酶催化和調(diào)節(jié)亞單位（Gclc、Gclm），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶同工酶類（GST），NAD(P)H:醌氧化還原酶1（Nqo1），血紅素氧化酶1（Ho1）。Nrf2屬于CNC（cap’n’collar）堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZIP）家族的轉(zhuǎn)錄因子，CNC家族還包括Nrf1和Nrf3。Nrf1和Nrf2正向調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)，而c-Fos和Fra1負(fù)向調(diào)節(jié)這一表達(dá)過程。萊菔硫烷（sulforaphane, SFN）自1992年被發(fā)現(xiàn)具有化學(xué)保護(hù)作用以來，逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。SFN具有抗腫瘤、抗氧化損傷、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等藥理作用，SFN通過分裂Nrf2-Keap1之間的連接誘導(dǎo)Ⅱ相酶，McWalter等用SFN喂養(yǎng)Nrf2敲除小鼠7d后仍然在胃、小腸、肝臟中發(fā)現(xiàn)Nqo1、GSTA1/2、GSTA3和GSTM1/2表達(dá)增加，雖不能與正常組比較，但說明可能還有另外的機(jī)制在起作用。有人認(rèn)為Nrf3負(fù)相調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)，具有一定的生理功能。因此，本實(shí)驗(yàn)欲利用萊菔硫烷干預(yù)Nrf2+/+，Nrf2-/-小鼠培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型探討Ⅱ相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1、Nrf2、Nrf3之間的關(guān)系。 第一部分原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立 目的：體外培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。 方法： 1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：將Nrf2+/+、Nrf2-/-新生乳鼠消毒、斷頭，取出大腦皮層，放于D-Hank's液中，解剖顯微鏡下剝離腦膜。將組織剪碎，胰蛋白酶消化，終止后離心，棄去上清液，重懸后將細(xì)胞懸液接種至25cm~2玻璃培養(yǎng)瓶底，放于37℃，5％CO~2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-36小時后換液，以后每4-5天換液一次，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。 2原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化及鑒定：將90%以上融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)搖床，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘，連續(xù)搖動3小時后更換培養(yǎng)液，放入CO~2培養(yǎng)箱中。用胰酶消化后，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿后取出，多聚甲醛固定，打孔，馬血清封閉；加入抗GFAP小鼠單克隆抗體，4℃搖床過夜。次日避光加入CY5標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗和Hochest染料，撈出小玻片用抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，照相。 結(jié)果：細(xì)胞的生長情況及鑒定：大腦皮層細(xì)胞培養(yǎng)約4-6小時后貼壁生長，為圓點(diǎn)狀帶有突起。24-48小時后細(xì)胞變大，突起變長，有少數(shù)細(xì)胞相互融合成片狀。12-14天后細(xì)胞約占95%以上，分為兩層，底層為片狀彼此融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)豐富，核偏位，突起較多較長，相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞彼此界限不明顯，上層為亮點(diǎn)狀小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞體積小，胞質(zhì)含量少，突起細(xì)長，細(xì)胞間界限明顯。經(jīng)搖床純化后，可見上層細(xì)胞脫落，細(xì)胞種類更為單一。星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP染色，95%以上為陽性細(xì)胞。 結(jié)論：培養(yǎng)出的細(xì)胞為原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，純度達(dá)95%以上，該細(xì)胞可用于體外Ⅱ相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2依賴關(guān)系的研究。 第二部分萊菔硫烷對Ⅱ相酶的誘導(dǎo)及其與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1、Nrf2、Nrf3關(guān)系的研究 目的：觀察萊菔硫烷對原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞Ⅱ相酶誘導(dǎo)情況，以及Ⅱ相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1、Nrf2、Nrf3的關(guān)系。 方法： 1Nrf2+/+、Nrf2-/-轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定：提取Nrf2+/+、Nrf2-/-小鼠尾尖DNA，分別以Nrf2+/+、Nrf2-/-引物PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 2實(shí)驗(yàn)分組及收集細(xì)胞：細(xì)胞分為兩組，即Nrf2+/+和Nrf2-/-組，每組又分為溶劑對照組和藥物干預(yù)組。首先給予Nrf2+/+組不同濃度的萊菔硫烷，即DMSO、2.5umol/l、5umol/l、10umol/l、15umol/l，通過測定Ⅱ相酶的表達(dá)來選擇最佳給藥濃度。然后分別給予Nrf2+/+、Nrf2-/-組DMSO和最適濃度的萊菔硫烷，24小時后棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，儲存于-80℃冰箱。 3Ⅱ相酶表達(dá)水平測定：用裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，每個樣品按20μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉后經(jīng)兔抗Gclc抗體（1:500）、兔抗Ho1抗體（1:500）、兔抗Gclm抗體（1:200)、羊抗Nqo1抗體（1:3000）或鼠抗Actin抗體（1:500）孵育，4℃搖床過夜。次日，洗膜后分別加入抗兔、抗羊或抗小鼠熒光二抗（1:10000）室溫孵育，Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃膜，分析結(jié)果。 4Nrf1、Nrf3的mRNA水平測定：取出Nrf2+/+、Nrf2-/-組藥物干預(yù)及對照組細(xì)胞，使用EasyPure RNAKit試劑盒提取RNA，測定RNA濃度，梯度PCR儀反轉(zhuǎn)錄為cDNA；分別加入Nrf1、Nrf3及GAPDH的上下游引物、TransStartGreenqPCR SuperMix、cDNA、Passive Reference Dye，建立擴(kuò)增體系，熒光定量PCR儀測定目的基因含量。 5統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計方法為單因素方差分析和秩和檢驗(yàn)。測定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1小鼠基因組DNA的Nrf2基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果示：700bp條帶陽性為Nrf2+/+小鼠；400bp條帶陽性為Nrf2-/-小鼠。 2不同濃度萊菔硫烷干預(yù)Ｎrf2+/+星形膠質(zhì)細(xì)胞示，10μmol/l對Ⅱ相酶Gclm、Nqo1、Ho1蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，因此認(rèn)為10μmol/l為最佳給藥濃度。 3Gss在Nrf2+/+和Nrf2-/-細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)有明顯差異，而Ho1、Nqo1、Gclc、Gclm則沒有差異。Nrf2+/+和Nrf2-/-細(xì)胞分別給予萊菔硫烷處理后，Ho1均能明顯上調(diào)。Nqo1和Gclm只在Nrf2+/+細(xì)胞中明顯上調(diào)，在Nrf2-/-細(xì)胞中不上調(diào)。而對于Gss和Gclc，給藥后Nrf2+/+和Nrf2-/-細(xì)胞兩種酶表達(dá)均無明顯變化。 4Nrf1、Nrf3mRNA表達(dá)變化：在Nrf2+/+細(xì)胞，萊菔硫烷干預(yù)后Nrf1、Nrf3mRNA均下降，與未干預(yù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；但是在Nrf2-/-細(xì)胞，萊菔硫烷干預(yù)后Nrf1和Nrf3mRNA均有下調(diào)，但與未干預(yù)組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。但Nrf3mRNA在Nrf2-/-給藥組明顯高于Nrf2+/+細(xì)胞給藥組,而Nrf1mRNA在Nrf2-/-與Nrf2+/+給藥組間無顯著差別。 結(jié)論： 1原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度高，可用于體外研究II相酶誘導(dǎo)通路。 210μmol/l萊菔硫烷對原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞Ho1的誘導(dǎo)不完全依賴于核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2；對Nqo1、Gclm的誘導(dǎo)很大程度上依賴于轉(zhuǎn)錄因子Nrf2；對Gss和Gclc的表達(dá)無明顯誘導(dǎo)作用。 3在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Nrf2存在情況下，Nrf2-ARE通路激活劑萊菔硫烷上調(diào)Ⅱ相酶時，轉(zhuǎn)錄因子Nrf1、Nrf3mRNA表達(dá)均受抑制；Nrf2敲除情況下，給予Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑，Nrf3可能在上調(diào)Ⅱ相酶過程中起一定代償作用。
[Abstract]:Oxidative stress plays an important role in the etiology of many diseases, the body produces an effective response to a series of threats against endogenous or exogenous oxidants brings, which is to maintain cell homeostasis and survival is essential. In the central nervous system, the transcription factor nuclear factor erythroid associated factor 2 (Nrf2 2) in protecting neurons astrocytes glial cell mediated, oxidative stress resistance plays a pivotal role in.Nrf2 promotion with antioxidant response element (ARE) transcription promoter sequence of antioxidant genes, these genes including glutamate cysteine ligase catalytic and regulatory subunits (Gclc, Gclm), glutathione S-transferase isoenzymes (GST), NAD (P) H: quinone oxidoreductase 1 (Nqo1), heme oxygenase 1 (Ho1) belongs to.Nrf2 CNC (cap 'n' collar) basic leucine zipper (bZIP) transcription factor family, CNC family also includes N RF1 and Nrf3.Nrf1 and Nrf2 positively regulates ARE mediated gene expression, whereas c-Fos and Fra1 negatively regulates the expression process. Sulforaphane (sulforaphane, SFN) since 1992, was found to have chemical protective effect, has gradually become a hot topic in.SFN research at home and abroad have antitumor, antioxidant, immunomodulatory, antibacterial etc. pharmacological effects of SFN through the connection between the Nrf2-Keap1 split phase enzyme induced by McWalter II, fed with SFN Nrf2 knockout mice 7d after small intestine remains in the stomach, GSTA1/2, Nqo1, found in the liver, GSTA3 and increase the expression of GSTM1/2, although not compared with the normal group, but that there may be another mechanism. People think that the expression of Nrf3 negatively regulate ARE mediated gene, with certain physiological functions. Therefore, this study intend to use sulforaphane treated Nrf2+/+ on astrocytes in primary cultured mouse model of Nrf2-/- induced phase II enzymes The relationship between conductance and nuclear transcription factor Nrf1, Nrf2, Nrf3.
The first part of the primary astrocyte model
Objective: to culture the primary astrocytes of mice in vitro.
Method錛

本文編號：1563528