本文選題：隱孢子蟲　切入點：純化卵囊　出處：《中國病原生物學(xué)雜志》2017年09期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的使用新的方法直接從少量糞便樣品中分離和純化隱孢子蟲卵囊,并進行全基因組擴增(whole genome amplification,WGA),從而獲得符合全基因組測序要求的隱孢子蟲DNA。方法 10份新鮮牛源隱孢子蟲糞便樣品,用蔗糖和氯化銫離心法分離卵囊,然后使用免疫磁珠試劑盒純化;用漂白水進行卵囊表面消毒,以除去細(xì)菌及真菌等病原微生物。采用QIAamp DAN Mini kit試劑盒提取基因組DNA,然后采用REPLI-g MIDI kit試劑盒進行WGA,最后,采用定量PCR對基因組DNA進行量和純度檢測。結(jié)果分離純化后的卵囊計數(shù)為2.81×104個/g~2.90×107個/g。提取基因組DNA后進行WGA,所有擴增產(chǎn)物均為大分子片段,表明WGA成功。WGA產(chǎn)物的DNA濃度為55.3ng/μl~357.5ng/μl。隱孢子蟲SSU rRNA基因的定量PCR擴增顯示,10份樣品純化WGA產(chǎn)物的CT值范圍為9.75~17.76,其中有7個樣品CT15,滿足全基因組測序要求。結(jié)論直接從糞便中分離和純化隱孢子蟲卵囊再進行WGA,可使隱孢子蟲的基因組DNA濃度和純度能達(dá)到測序要求,該方法使隱孢子蟲全基因測序常規(guī)化是可行的。
[Abstract]:Objective to isolate and purify Cryptosporidium oocysts directly from a small amount of fecal samples by a new method. The whole genome amplification was carried out to obtain Cryptosporidium sinensis DNA.Methods Ten samples of fresh bovine Cryptosporidium faeces were isolated by sucrose and cesium chloride centrifugation. Then purified by immunomagnetic bead kit, and disinfected with bleached solution to remove bacteria and fungi, genomic DNA was extracted by QIAamp DAN Mini kit kit, and then WGA was obtained by REPLI-g MIDI kit kit. Quantitative PCR was used to detect the quantity and purity of genomic DNA. Results the egg sac count after isolation and purification was 2.81 脳 10 4 / g, 2.90 脳 10 7 / g. The genomic DNA was extracted for WGA, and all the amplified products were macromolecular fragments. The results showed that the concentration of DNA of WGA was 55.3 ng / 渭 ll 357.5 ng / 渭 l.The quantitative PCR amplification of Cryptosporidium rRNA gene showed that the CT value range of purified WGA product from 10 samples of Cryptosporidium was 9.75 ~ 17.76, and CT15 of 7 samples met the requirement of genome sequencing. Conclusion\\\; The concentration and purity of genomic DNA of Cryptosporidium can meet the requirements of sequencing if WGA is used to isolate and purify Cryptosporidium oocysts from feces. This method is feasible to sequence the whole gene of Cryptosporidium.
【作者單位】： 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室;道里區(qū)人民醫(yī)院;
【基金】：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.12541280)
【分類號】：R382.3

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本文編號：1560565