發(fā)布時間：2018-02-25 21:43

  本文關(guān)鍵詞： 聚N-異丙基丙烯酰胺 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 脂肪干細(xì)胞 溫敏性材料 非酶解收獲　出處：《大連理工大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：干細(xì)胞是—類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞,其在組織工程、基因工程等生物醫(yī)藥領(lǐng)域起著舉足輕重的作用。但來源于人或動物的組織或體液中的原始干細(xì)胞數(shù)量不足,很難滿足臨床應(yīng)用的需要,因此需要構(gòu)建干細(xì)胞的體外擴(kuò)增體系。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時會經(jīng)歷反復(fù)的接種-收獲過程,酶解法依然廣泛應(yīng)用于細(xì)胞回收過程中。但是酶類物質(zhì)的介入會導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白的損傷,而膜蛋白的變異會致使細(xì)胞功能障礙或功能缺失,這可能會削弱干細(xì)胞在治療醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用潛能。因此有必要選取更為合理的干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系和回收方式。研究表明溫敏性材料聚N-異丙基丙烯酰胺(poly (N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)可以替代酶類物質(zhì)用于貼壁細(xì)胞的收獲。采用PNIPAAm材料的降溫脫附法可以更有效地保護(hù)細(xì)胞膜蛋白和相關(guān)受體,從而維護(hù)細(xì)胞的生理功能。如果將PNIPAAm材料的研發(fā)與干細(xì)胞的體外培養(yǎng)相結(jié)合,那么有望實現(xiàn)為組織工程提供優(yōu)良種子細(xì)胞的目標(biāo)。 首先合成了一種新型的以PNIPAAm為主體的共聚物,并對其溫敏特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子組成及分子量等進(jìn)行了相關(guān)檢測。以N-異丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide, NIPAAm)、甲基丙烯酸羥丙酯(hydroxypropyl methacrylate, HPM)和甲基丙烯酸(3-三甲氧基硅)丙酯(3-trimethoxysilylpropyl methacrylate, TMSPM)為合成原料,以偶氮二異丁腈(2-azobisisobutyronitrile, AIBN)為引發(fā)劑,以無水乙醇為溶劑采用自由基聚合法合成了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物。采用動態(tài)光散射儀確定了共聚物在水溶液中的溫敏特性,及其最低臨界溶液溫度(lower critical solution temperature, LCST)為29℃；傅里葉變換紅外光譜證實了共聚物中酰胺鍵,異丙基鍵,羥基,硅氧烷鍵,酯基等特征官能團(tuán)的存在；核磁共振氫譜進(jìn)而確定了總產(chǎn)物中三種反應(yīng)物之間的摩爾比例,即NIPAAm:HPM:TMSPM=18:1:1;凝膠滲透色譜測定了終產(chǎn)物的分子量,即重均分子量Mw為192kD,數(shù)均分子量Mn為119kD,多分散性系數(shù)Mw/Mn為1.6,聚合度為45。結(jié)果表明所合成的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物具有溫敏特性,但HPM和TMSPM的加入使LCST降低了2-3℃。 進(jìn)而將合成的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物接枝聚合到含有羥基的基底上,從而形成一種新型的共聚物膜,并對其性能進(jìn)行了相關(guān)檢測。將P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物溶于無水乙醇,配置成不同濃度的共聚物溶液,然后采用旋轉(zhuǎn)涂膜儀以相同的旋轉(zhuǎn)速度和旋轉(zhuǎn)時間在硅片和蓋玻片上進(jìn)行涂膜,在真空和高溫條件下退火,經(jīng)過無水乙醇和超純水浸泡清洗后,室溫下真空干燥。采用接觸角測量儀,原子力顯微鏡和橢圓偏振儀分別測定了共聚物膜的表面接觸角,表面形貌和總體厚度隨溫度及共聚物濃度的變化趨勢。實驗結(jié)果顯示在給定濃度的干燥或濕潤狀態(tài)下,以共聚物濃度2mg·mL-1為分界點,共聚物膜上水的接觸角隨著共聚物濃度的增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢,而在相同濃度下,干膜上水的接觸角高于濕膜上的接觸角,并且20℃時的接觸角要低于37℃時的接觸角；隨著共聚物濃度的增加,室溫條件下共聚物干膜的厚度不斷增加,其表面粗糙度也隨之增大；超純水中的共聚物膜在20℃會發(fā)生體積溶脹,而當(dāng)溫度升至37℃時,則呈現(xiàn)皺縮的狀態(tài),如果體系溫度不斷在20℃和37℃之間反復(fù)變化,共聚物膜則呈現(xiàn)可逆性的體積變化。上述變化規(guī)律和趨勢表明共聚物顆粒已經(jīng)通過硅氧烷鍵和羥基的鍵合而接枝到基底材料上,且完成了顆粒之間的鏈接。通過調(diào)節(jié)共聚物的濃度可以控制P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜的表面潤濕性、表面結(jié)構(gòu)和厚度,且該膜具備溫敏性、可控性、可逆性和穩(wěn)定性。 之后,將HeLa細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞接種到P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜上,觀察這些細(xì)胞在37℃和20℃時的粘附和脫附狀態(tài)。結(jié)果表明不同細(xì)胞的生長和脫附對膜厚度及表面潤濕性的要求不同,因此在將溫敏性膜材料用于干細(xì)胞的培養(yǎng)和收獲之前,有必要進(jìn)行適宜膜的篩選。 最后,將骨髓及脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs或adipose-derived stem cells, ADSCs)培養(yǎng)在適合其生長和脫附的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜和蓋玻片上,用降溫脫附法與胰酶消化法分別收獲細(xì)胞,如此傳代培養(yǎng)3次后,進(jìn)行細(xì)胞活力、免疫表型、增殖能力、分化潛能及蛋白質(zhì)殘留情況等方面的檢測。結(jié)果表明,兩種方法收獲的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、骨和軟骨發(fā)生能力(BMMSCs)或脂肪發(fā)生能力(ADSCs)等方面并未展現(xiàn)明顯的差異,但降溫脫附法收獲的細(xì)胞與對照組相比卻具有更好的細(xì)胞活性,更強(qiáng)的增殖能力,更高的成脂肪分化能力(BMMSCs)或成骨和成軟骨能力(ADSCs)以及更多的蛋白質(zhì)殘留。因此,P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜上培養(yǎng)干細(xì)胞并使用降溫脫附收獲細(xì)胞,在保持細(xì)胞增殖能力和維護(hù)細(xì)胞功能方面均優(yōu)于傳統(tǒng)胰酶消化法。 本研究制備了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物和共聚物膜,并且成功地將它們應(yīng)用于干細(xì)胞的培養(yǎng)和非酶解收獲中,這為溫敏性培養(yǎng)基底的制備以及干細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供了新的思路和技術(shù)手段。如果將這種溫敏膜制備于微載體或中空纖維膜上,再結(jié)合生物反應(yīng)器技術(shù),則有望形成新的體外大規(guī)模擴(kuò)增干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329;Q813

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 武爽;溫敏性表面的制備及其在貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)與收獲中的應(yīng)用[D];大連理工大學(xué);2013年

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本文編號：1535270