本文關(guān)鍵詞： 電化學(xué)傳感器 金納米顆粒 發(fā)夾型探針 DNA甲基化酶 抑制劑　出處：《湖南大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：DNA甲基化是表觀遺傳中最主要的作用方式，其在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡、胚胎發(fā)育、維持正常細(xì)胞功能等過(guò)程中起著極其重要的作用。人類許多重大疾病如癌癥、遺傳性疾病都與DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相關(guān)。因此，研究DNA甲基化過(guò)程和分析DNA甲基化酶活性，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。由于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在耗時(shí)、不連續(xù)、大多需要放射性標(biāo)記等缺點(diǎn)，于是發(fā)展新的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的甲基化監(jiān)測(cè)手段和甲基化酶檢測(cè)方法便已成為生化分析和臨床診斷等領(lǐng)域愈加迫切的需求。電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)快速、易于微型化、測(cè)試費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在各種目標(biāo)物的檢測(cè)中得到了廣泛的研究和應(yīng)用，也為DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究提供了新的契機(jī)。本論文以甲基化酶活性的高靈敏檢測(cè)為目標(biāo)，基于核酸分子探針及納米材料信號(hào)放大作用構(gòu)建了不同的電化學(xué)生物傳感器，主要包括以下三方面的研究工作： 一、基于金納米顆粒信號(hào)放大作用的DNA甲基化酶免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè) 利用DNA功能化金納米顆粒的信號(hào)放大作用，發(fā)展了一種便捷、高靈敏電化學(xué)檢測(cè)Dam甲基化酶活性的新方法。首先在金電極上修飾單鏈DNA，當(dāng)不存在Dam甲基化酶時(shí)，互補(bǔ)DNA修飾的金納米顆粒通過(guò)雜交作用，靠近電極表面，此時(shí)是“eT OFF”狀態(tài)；當(dāng)檢測(cè)體系中有Dam甲基化酶和Dpn I限制性內(nèi)切酶時(shí)，DNA雙鏈被甲基化并切斷，使得金納米顆粒遠(yuǎn)離電極表面，電子可以自由傳遞，產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)（eT ON）。金納米顆粒自身的空間位阻作用會(huì)阻礙電極表面的電子傳遞，同時(shí)，金納米顆粒上修飾有大量帶負(fù)電荷的DNA，由于靜電斥力，進(jìn)一步阻礙帶負(fù)電荷的電活性物質(zhì)鐵氰化鉀與電極表面的電子傳遞，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Dam甲基化酶的特異性檢測(cè)，檢測(cè)限為0.12U/mL，并且能用于對(duì)甲基化酶敏感藥物的篩選。 二、基于甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型捕獲探針電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化酶活性 結(jié)合亞甲基藍(lán)標(biāo)記的報(bào)告探針和甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型捕獲探針，構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)甲基化酶活性。在該方法中，發(fā)夾型捕獲探針的莖部包含甲基化酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)甲基化酶不存在時(shí)，發(fā)夾型結(jié)構(gòu)保持完整，捕獲探針?lè)忾]在其莖部結(jié)構(gòu)中，這阻礙了報(bào)告探針與捕獲探針之間的雜交，使得標(biāo)記在報(bào)告探針上的電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)不能靠近電極表面，處于“eT OFF”狀態(tài)。而當(dāng)甲基化酶存在時(shí)，該位點(diǎn)被甲基化，進(jìn)而被限制性內(nèi)切酶切割，使得與報(bào)告探針互補(bǔ)的捕獲鏈暴露出來(lái)，通過(guò)DNA鏈之間的互補(bǔ)配對(duì)，報(bào)告探針上標(biāo)記的亞甲基藍(lán)靠近電極，從而發(fā)生電子傳遞，產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。以Dam甲基化酶為例，該方法檢測(cè)限為0.07U/mL，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化酶的動(dòng)力學(xué)研究及相關(guān)抑制劑篩選。 三、基于發(fā)夾型探針和G-四聚體結(jié)構(gòu)免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化酶 將電活性物質(zhì)Hemin可以特異性的與富G序列結(jié)合形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的G-四聚體這一特性，應(yīng)用于甲基化酶活性的電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)計(jì)了甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型探針，其莖部包含甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)及一段特異性的富G序列，當(dāng)甲基化酶不存在時(shí)，該序列被封鎖在發(fā)夾型探針的莖部，不能與Hemin結(jié)合，從而沒(méi)有電化學(xué)信號(hào)的產(chǎn)生，此時(shí)是“eT OFF”的狀態(tài)；當(dāng)甲基化酶和限制性內(nèi)切酶存在時(shí)，發(fā)夾型探針莖部甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)被甲基化并被切割，暴露出能與Hemin結(jié)合的富G序列，使得Hemin靠近電極表面，產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Dam甲基化酶快速，便捷，高靈敏的電化學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)下限為0.2U/mL。
[Abstract]:DNA methylation plays a very important role in the process of gene expression regulation , genome imprinting , embryo development and normal cell function . 1 . DNA methylase - free electrochemical detection based on gold nanoparticle signal amplification A novel method for detecting Dam methylase activity by using DNA functionalized gold nanoparticles is developed . Firstly , single - stranded DNA is modified on the gold electrode . When there is no Dam methylase , the complementary DNA - modified gold nanoparticles are hybridized to the surface of the electrode , which is the " eT OFF " state . When the detection system has Dam methylase and DpnI restriction enzyme , the DNA double - stranded DNA is methylated and cut off so that the gold nanoparticles are away from the surface of the electrode , electrons can be freely transferred , and the detectable electrochemical signal ( eT ON ) can be generated . A large amount of negatively charged DNA is modified on the gold nanoparticles . Due to the electrostatic repulsive force , the electron transfer between the potassium cyanide and the electrode surface of the negatively charged electroactive material is further hindered , thereby realizing amplification of the signal . 2 . Detection of DNA methylase activity electrochemically by hairpin - type capture probe based on methylation response A sensitive electrochemical biosensor for detecting methylase activity is constructed in combination with methylene blue - labeled reporter probes and methylation - responsive hairpin - type capture probes . In this method , the hairpin - type capture probes contain methylase recognition sites . III . DNA methylase - free electrochemical detection based on hairpin - type probes and G - tetrameric structures A hairpin - type probe with stable structure is formed by binding an electroactive substance Hemin with a rich G sequence to form a G - tetramers with stable structure . The hairpin - type probe is designed with methylation response , and the stem part of the hairpin - type probe is blocked on the stem part of the hairpin type probe when the methylase does not exist ;

【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1533085