本文關(guān)鍵詞： 人組織激肽釋放酶 人組織激肽釋放酶5 抗體制備 ELISA　出處：《泰山醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 人組織激肽釋放酶基因家族（Kallikreins，KLKs）是一種新型腫瘤標(biāo)志物家族，包括15個成員（KLK1-KLK15）。人組織激肽釋放酶基因5（Kallikrein5，KLK5）是該家族成員之一，既往研究證實(shí)KLK5在激素相關(guān)腫瘤中異常表達(dá)且與腫瘤的形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有高度相關(guān)性。本課題以人組織激肽釋放酶5（human Kallikein5，hK5）重組蛋白為抗原制備兔抗hK5多克隆抗體和鼠抗hK5單克隆抗體，并建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法；通過對多種腫瘤血清和健康體檢血清標(biāo)本的檢測，對其臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步評價(jià)。 方法 1．通過表達(dá)條件的優(yōu)化使hK5重組蛋白高效表達(dá)，并通過Ni-NTA柱純化出重組hK5蛋白；經(jīng)SDS-PAGE分離檢測目的蛋白的純度和分子量；Western blot方法檢測目的蛋白的特異性和BCA方法測定蛋白濃度。 2．以目的蛋白為抗原對新西蘭大白兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫，末次免疫一周后，應(yīng)用間接ELISA方法檢測抗體效價(jià)；對新西蘭大白兔進(jìn)行心臟采血并分離血清，-80℃保存?zhèn)溆�；以重組蛋白免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)誘生含單克隆抗體的腹腔積液并收集。用Protein A純化試劑盒純化抗血清及腹腔積液，所得抗體進(jìn)行免疫組化（immunohistochemistry，IHC）和Western blot檢測。 3．以單克隆抗體為捕獲抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體為檢測抗體；采用棋盤滴定法確定最佳工作濃度，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法；通過對臨床血清標(biāo)本的檢測對檢測方法進(jìn)行初步評價(jià)。 結(jié)果 1．通過對誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，最終確定在28℃條件下，IPTG終濃度為1mM誘導(dǎo)8h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到峰值，重組蛋白是以可溶性形式存在細(xì)菌裂解液中。目的蛋白分子量約為28kD。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白可以與anti-his抗體特異性的結(jié)合。 2．分離免疫兔血清，間接ELISA方法檢測血清效價(jià)約達(dá)1:106；Western blot結(jié)果證實(shí)了所得多克隆抗體可以特異性的與目的蛋白結(jié)合，具有較高的特異性；IHC結(jié)果分析表明：hK5定位于細(xì)胞漿內(nèi)，在卵巢癌、胃癌組織細(xì)胞中均有表達(dá)。利用雜交瘤技術(shù)篩選出4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B4，2D4，3B6，3F8；通過動物體內(nèi)誘生方法制備了含大量單克隆抗體的腹腔積液，間接ELISA方法檢測腹水效價(jià)達(dá)1:105，，通過純化得到高純度的單克隆抗體。Western blot和IHC結(jié)果證實(shí)單克隆抗體有高度特異性。 3．雙抗體夾心ELISA方法的最佳工作條件為：包被抗體濃度為7.5μg/mL，酶標(biāo)抗體最佳稀釋比例為1:1000（1μg/mL），該方法的檢測范圍為0.45-125ng/mL，檢測下限為0.2ng/mL。對臨床血清標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示：hK5在卵巢癌血清中含量為（3.77±1.47）ng/mL，顯著高于健康女性血清（0.86±0.45）ng/mL（P0.01），40例卵巢癌患者血清其中有27例（67.5%）hK5含量升高（1.76ng/mL）；在結(jié)直腸癌血清中含量為（0.50±0.18）ng/mL，顯著低于正常血清（0.72±0.41）ng/mL（P0.05）。 結(jié)論 1．制備了高效價(jià)、高特異性的兔抗hK5多克隆抗體和鼠抗hK5單克隆抗體。 2．構(gòu)建了雙抗體夾心ELISA檢測方法，可定量分析血清中hK5含量。 3．hK5在大部分卵巢癌患者血清中含量顯著高于健康女性血清，而在大部分結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)量較正常血清下降。
[Abstract]:Purpose The human tissue kallikreins ( KLK5 ) is a new type of tumor marker family , including 15 members ( KLK15 ) . Human tissue kallikrein5 ( KLK5 ) is one of the members of the family . Previous studies have shown that KLK5 is abnormally expressed in hormone - related tumors and is highly correlated with the formation , development and metastasis of tumor . method 1 . High - efficiency expression of hK562 recombinant protein was carried out by optimizing the expression condition , and the recombinant hK562 protein was purified by Ni - nta column ; the purity and molecular weight of the target protein were determined by SDS - PAGE ; and the specificity of the target protein and the BCA method were used to measure the protein concentration . 2 . immunizing BALB / c mice with recombinant protein by immunizing BALB / c mice with recombinant protein , immunizing BALB / c mice with recombinant protein , purifying antiserum and peritoneal effusion with protein A purification kit , and carrying out immunohistochemistry ( immunohistochemistry , IHC ) and Western blot . 3 . The monoclonal antibody is used as the capture antibody , the polyclonal antibody labeled with horseradish peroxidase is used as the detection antibody , the optimal working concentration is determined by using a chessboard titration method , and a double antibody sandwich ELISA detection method is established ; and the detection method is preliminarily evaluated by detecting the clinical serum specimen . Results 1 . By optimizing the induction conditions , it was determined that at 28 鈩

本文編號：1529674