本文關(guān)鍵詞： 白介素1受體拮抗劑 殼聚糖 間充質(zhì)干細胞 細胞移植　出處：《南京大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自體骨髓間充質(zhì)干細胞是一種來源廣泛,取材簡單、免疫原性低,具有多向分化潛能的成體干細胞。治療急性肝衰竭具有極大的應(yīng)用前景。在發(fā)現(xiàn)肝衰竭炎癥內(nèi)環(huán)境嚴重影響移植細胞活性及功能的基礎(chǔ)上,選用臨床廣泛應(yīng)用的乳糖�；鶜ぞ厶亲鳛檩d體材料,構(gòu)建具有肝靶向作用的白細胞介素1受體拮抗劑載藥納米緩釋粒子。為了更好的示蹤移植干細胞體內(nèi)分布和轉(zhuǎn)化等功能發(fā)揮,前期進行慢病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs),以獲取GFP-MSCs細胞系。將載藥納米粒子通過外周靜脈注入體內(nèi),利用其肝靶向性到達肝內(nèi)；隨后自體MSC通過門靜脈移植至肝內(nèi),兩者聯(lián)合應(yīng)用于豬急性肝衰竭的治療。以期通過該載藥粒子的局部藥物靶向緩釋,改善肝衰的炎癥內(nèi)環(huán)境,從而提高移植細胞的活性和功能,促進自體骨髓間充質(zhì)干細胞在肝內(nèi)的增殖與分化,促進肝再生,改善肝臟功能。 第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)、擴增、標記和鑒定 目的：使用慢病毒介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染,以獲取GFP-MSCs細胞系,示蹤移植干細胞體內(nèi)各種生物行為。 方法：采用密度梯度離心法分離豬骨髓間充質(zhì)干細胞,貼壁培養(yǎng)法不斷傳代純化,并用慢病毒介導(dǎo)外源熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染MSCs,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后MSCs表面標志物和熒光表達強度,MTT法檢測轉(zhuǎn)染后MSCs增殖能力。 結(jié)果：骨髓單個核細胞經(jīng)過多次傳代,間充質(zhì)干細胞不斷貼壁生長,形態(tài)比較均一,呈長梭形,類似成纖維細胞,而雜質(zhì)細胞逐漸減少。將純化的MSC細胞與MOI80帶有嘌呤霉素抗性的慢病毒孵育,一段時間后,經(jīng)嘌呤霉素篩選出熒光強度較強,并長期維持較高水平的GFP-MSC細胞系。流式細胞分析顯示MOI80時,感染效率為80%,平均熒光強度為11076。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD90+、CD44+的細胞占總細胞數(shù)的百分比90%(圖2),CD45幾乎不表達,表明外源基因轉(zhuǎn)染的MSC細胞仍保持間充質(zhì)干細胞特性,且純度較高。MTT法顯示GFP-MSC與普通MSC一周內(nèi)的生長規(guī)律相似且兩組細胞在各個時間點的吸光度值無明顯差異。 結(jié)論：熟練掌握密度梯度離心法分離、培養(yǎng)和純化豬骨髓MSCs,且形態(tài)規(guī)則、增殖能力強,符合下一步實驗要求：在此基礎(chǔ)上通過慢病毒介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染MSCs構(gòu)建GFP-MSCs細胞系,且FCM顯示轉(zhuǎn)染后細胞仍保持間充質(zhì)干細胞特性,且純度較高,可作為報告基因穩(wěn)定有效示蹤MSCs的肝內(nèi)分布。 第二部分IL-1Ra納米緩釋顆粒的制備及功能驗證 目的：制備IL-Ra乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒,為有效改善ALF炎癥內(nèi)環(huán)境提供理想有效的方法。 方法：采用靜電噴射法制備IL-Ra乳糖酰基殼聚糖納米顆粒；采用FITC熒光標記的乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒分別與肝細胞和MSC孵育,熒光顯微鏡下觀察其肝細胞靶向性,流式細胞儀檢測兩種細胞激發(fā)熒光的比例和強度；ELISA法檢測IL-Ra乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒外周靜脈注射24h后心、肝、腎等組織中IL-Ra含量；ELISA法檢測IL-Ra乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒在PBS液中的釋放規(guī)律。 結(jié)果：紅外譜圖顯示乳糖酸(LA)的羧基特征峰(1742.66cm-1)消失,殼聚糖(chitosan, CS)的氨基特征峰發(fā)生偏移；核磁共振圖譜顯乳糖�；鶜ぞ厶�(GC)的特征峰(4.3ppm)為乳糖酸羧基與殼聚糖氨基反應(yīng)生成的酰胺鍵上氫的的特征峰。掃描電鏡顯示制備出的IL-1Ra乳糖酰基殼聚糖納米顆粒形貌良好,分布均勻。熒光顯微鏡下未見圍繞分枝狀MSC細胞的綠色熒光,而所有肝細胞均靶向有綠色熒光的納米顆粒。流式細胞儀分析被靶向的肝細胞比例達到97.2%,熒光強度幾何平均值較對照組高出近十倍。肝組織研磨液ELISA法檢測IL-1Ra濃度平均值為147.15pg/ml,顯著高于血清、腎臟和心臟組織,同時與血清成分相比有顯著差異(P0.05)。ELISA檢測IL-1Ra緩釋過程：1-3h突釋峰,3-9h的平臺期,9-30h快速釋放峰,最后累計釋放量趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示IL-1Ra納米顆粒經(jīng)過兩次快速釋放后IL-1Ra累計釋放量在30%左右,還有大部分IL-1Ra控釋在納米顆粒中。 結(jié)論：采用靜電噴射法在接收距離為10cm,流速為0.7ml/h,電壓為14kV的操作條件下,穩(wěn)定噴射,成功制備出形貌較優(yōu),分布均勻,包封率較高的IL-1Ra乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒。體外及體內(nèi)實驗進一步證實其具有顯著的肝細胞靶向性及緩釋功能。這為IL-1Ra應(yīng)用于急性肝衰竭解提供了良好的思路。 第三部分IL-1Ra納米緩釋顆粒聯(lián)合MSCs移植治療豬ALF的實驗研究 目的：探討炎癥因子拮抗劑與干細胞移植聯(lián)合治療肝功能衰竭的協(xié)同效應(yīng)及其機理,為干細胞移植治療肝功能衰竭提供更廣闊的應(yīng)用途徑。方法：D-氨基半乳糖(D-Gal)誘導(dǎo)建立豬急性肝衰竭模型,34中華實驗小型豬隨機分為五組,造模對照組：門靜脈移植生理鹽水；IL-1Ra組：門靜脈移植生理鹽水前6h耳背大靜脈推注IL-1Ra;單純骨髓間充質(zhì)干細胞移植組：門靜脈移植8×107骨髓間充質(zhì)干細胞；聯(lián)合治療組(包括IL-1Ra聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植組和IL-1Ra納米顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植組)：耳背大靜脈推注IL-1Ra或IL-1Ra納米緩釋顆粒,門靜脈移植8×107異體骨髓MSCs。移植后4周內(nèi)定期檢測肝功能、炎癥因子變化和病理改變并監(jiān)測移植細胞體內(nèi)存活、轉(zhuǎn)化和分泌情況。 結(jié)果：各組存活動物肝功能在2-3周基本恢復(fù)到正常水平,與其余各組比較,E組肝功能顯著改善(P0.05)。B超檢測腹水顯示納米顆粒組一周時僅少量腹水,不易測量,單純細胞移植組最大腹水距離為3.97cm,肝衰竭對照組最大腹水距離為5.35cm。 ELISA檢測各組血清炎癥指標動態(tài)變化情況均為造模24h后迅速上升,短時間內(nèi)到達高峰,持續(xù)數(shù)日后緩慢下降；與對照組比較,納米顆粒組IL-1、TNF-α、和IL-6均顯著改善(P0.05)。Ki67陽性細胞在肝衰竭3天迅速上升,1周時達到高峰；A、B組增殖細胞數(shù)隨后直線下降,第3周恢復(fù)正常增殖水平(21.2±2.5),E組雖有降低,但維持在較高水平(68.8±9.1)(P0.05)。熒光顯微鏡及抗GFP免疫組化結(jié)果均可見2周末納米顆粒組移植細胞數(shù)較單純移植組明顯增多,且前者肝小葉實質(zhì)內(nèi)可見散在分布的移植細胞。免疫熒光染色顯示分布于肝臟的移植細胞(綠色熒光)并未同時顯示紅色熒光的CK18,相反,western blot檢測C、D、E組肝組織HGF、VEGF的表達量明顯高于對照組,且以納米顆粒組最多。 結(jié)論：IL-1Ra乳糖�；鶜ぞ厶羌{米顆粒通過對宿主內(nèi)環(huán)境的持續(xù)有效控制協(xié)同移植干細胞的多種分泌功能共同促進肝衰竭動物的恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R657.3;R-332

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本文編號：1523475