本文關(guān)鍵詞： KLF4 細(xì)胞骨架 PDGF-BB 血管平滑肌細(xì)胞 actin CRM1　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMC）表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的主要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。KLF4（Krüppel-like factor4）是Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，該家族是具有鋅指結(jié)構(gòu)的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛的參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和癌癥發(fā)生等過程。KLF4主要定位于胞核，通過激活分化標(biāo)志基因（如SM α-actin、SM22α）的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化的作用。目前對KLF4功能主要局限在細(xì)胞核，關(guān)于KLF4在胞漿的分布及其功能尚少有報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB可以促進(jìn)KLF4表達(dá)和核輸出，但KLF4在胞漿中的定位和功能尚不清楚。本研究以PDGF-BB為誘導(dǎo)因素，探討了KLF4調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)的分子機(jī)制。 方法：細(xì)胞免疫熒光染色分析檢測KLF4與細(xì)胞骨架的相互作用；Western blot分析檢測KLF4出入核的途徑；GST pull-down分析檢測KLF4與actin相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；報(bào)告基因分析檢測KLF4對SM22α啟動(dòng)子活性的影響。 結(jié)果： 1CRM1介導(dǎo)KLF4出核 用CRM1阻斷劑LMB（20ng/mL）預(yù)處理VSMC8h后，再給予PDGF-BB（20ng/mL）刺激VSMC2h，分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，與對照組相比，LMB可以顯著抑制PDGF-BB對KLF4出核的誘導(dǎo)作用。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示，與對照組相比，PDGF-BB處理增加KLF4在胞漿中的分布，給予LMB預(yù)處理后，胞漿中幾乎看不到KLF4分布。提示，PDGF-BB通過CRM1途徑誘導(dǎo)KLF4核輸出。 2KLF4參與細(xì)胞骨架重構(gòu)，具有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用 用pEGFP-N1和pEGFP-N1-KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMC后，再用PDGF-BB、細(xì)胞骨架聚合劑（JPK)、細(xì)胞松弛素(CB)處理細(xì)胞，觀察KLF4亞細(xì)胞定位的變化。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞含有大量平行束狀纖維，PDGF-BB刺激后，束狀分布的應(yīng)力纖維減少，肌絲排列成為網(wǎng)狀。CB刺激后，應(yīng)力纖維消失，微絲解聚，呈彌散狀分布于胞質(zhì)中，細(xì)胞無法維持正常的形態(tài)。相反，JPK則使細(xì)胞應(yīng)力纖維變的粗大。KLF4過表達(dá)可以促進(jìn)肌絲成束，應(yīng)力纖維增粗。轉(zhuǎn)染KLF4后再給予PDGF-BB刺激，肌絲仍保持束狀排列，沒有明顯的網(wǎng)格化改變；還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4也可以抵抗CB誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維解聚，，提示，KLF4在胞漿中有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。 3KLF4通過與actin相互作用參與細(xì)胞骨架重構(gòu) 為了明確KLF4參與細(xì)胞骨架重構(gòu)及穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用是否與其和SM α-actin相互作用有關(guān)，我們分別用PDGF-BB、CB、JPK處理VSMC2h后，觀察KLF4與actin的相互作用。免疫雙熒光細(xì)胞共定位分析結(jié)果顯示，PDGF-BB使KLF4在胞漿中的分布增加，并與actin在胞漿外邊緣相互重合為黃色熒光；CB使肌絲解聚為彌散狀，且胞漿中TRITC標(biāo)記的KLF4與FITC標(biāo)記的actin無明顯的熒光重疊；JPK使肌絲聚合呈束狀，應(yīng)力纖維粗大，KLF4與actin共定位更加明顯。上述結(jié)果表明，KLF4通過與actin相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的解聚和聚合。 4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin與KLF4結(jié)合所必須的 為了進(jìn)一步明確KLF4與actin相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們用KLF4不同截短體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后通過GST親和層析純化，得到分子量不同的的GST-KLF4-2、GST-KLF4-3、GST-KLF4-4、GST-KLF4-全長融合蛋白。將結(jié)合有5種融合蛋白的GST-Sepharose4B與VSMC融合蛋白裂解液共孵育8h，沉淀經(jīng)充分洗滌后，進(jìn)行SDS-PAGE分離及Western blot分析。結(jié)果顯示，GST-KLF4-3與actin之間有較強(qiáng)的相互作用，其他融合蛋白上結(jié)合的actin較少。以上結(jié)果證實(shí)，KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin與KLF4相互作用的結(jié)構(gòu)域。 5KLF4磷酸化和蘇素化修飾影響細(xì)胞骨架的重構(gòu) 為了確定KLF4修飾與細(xì)胞骨架重構(gòu)的關(guān)系，我們分別用KLF4磷酸化位點(diǎn)Ser-251和Ser-255突變體表達(dá)載體和蘇素化位點(diǎn)k-225+229突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染VSMC后，給予PDGF-BB刺激，細(xì)胞免疫熒光染色法觀察不同突變體對細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，沒有給予PDGF-BB處理時(shí)，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞骨架均為束狀，無明顯區(qū)別；但是給予PDGF-BB后，轉(zhuǎn)染磷酸化位點(diǎn)突變體的細(xì)胞，細(xì)胞骨架發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為應(yīng)力纖維增粗，向細(xì)胞邊緣聚集，細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切巍＾D(zhuǎn)染蘇素化位點(diǎn)突變體后，應(yīng)力纖維也增粗，但排列明顯無序紊亂。提示PDGF-BB誘導(dǎo)的KLF4磷酸化和蘇素化均參與了細(xì)胞骨架重構(gòu)的調(diào)節(jié)。 結(jié)論： 1CRM1介導(dǎo)KLF4出核 2KLF4參與細(xì)胞骨架重構(gòu)，具有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用 3KLF4通過與actin相互作用參與細(xì)胞骨架重構(gòu) 4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin與KLF4結(jié)合所必須的 5KLF4磷酸化和蘇素化修飾影響細(xì)胞骨架的重構(gòu)
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 狄柯坪;韓梅;溫進(jìn)坤;;旋覆花提取物抑制血管內(nèi)皮剝脫后內(nèi)膜增生的實(shí)驗(yàn)研究[J];中草藥;2007年01期

本文編號：1523071