本文關(guān)鍵詞： 鼠疫菌 sRNA cDNA文庫(kù) RNA組學(xué)　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 非編碼RNA(ncRNA)作為基因組最大的一類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,在生物的生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境改變的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的調(diào)控作用。細(xì)菌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA,稱為“調(diào)節(jié)小RNA”(sRNA)。鼠疫的病原菌--鼠疫菌鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)是多一種多宿主寄生菌,面對(duì)多宿主復(fù)雜的環(huán)境因素,鼠疫菌必須能夠感應(yīng)并快速適應(yīng)每個(gè)環(huán)節(jié)的環(huán)境變化,才能最終在宿主體內(nèi)存活和在自然界中傳播并最終致病,而每個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)也必然伴隨著嚴(yán)格的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。人們已經(jīng)做了大量關(guān)于鼠疫菌的面臨環(huán)境壓力時(shí)的適應(yīng)性調(diào)控工作,但大都集中在研究調(diào)控基因和蛋白質(zhì)調(diào)控子上。而對(duì)于鼠疫菌的sRNA的研究,尤其是在面臨復(fù)雜環(huán)境變化時(shí)的sRNA調(diào)控,研究工作幾乎為空白。在早期的sRNA研究中,大多是采用計(jì)算機(jī)對(duì)基因組預(yù)測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)新的ncRNA。但是由于ncRNA沒(méi)有像mRNA那樣的保守序列(ORF,起始和終止密碼子,多聚腺苷酸化信號(hào)等),且一般較短,因此導(dǎo)致一維結(jié)構(gòu)缺乏足夠的統(tǒng)計(jì)信號(hào),造成計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)ncRNA序列遠(yuǎn)比預(yù)測(cè)編碼蛋白基因困難得多。隨后人們采用傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法來(lái)發(fā)現(xiàn)新的ncRNA。通過(guò)這種方法,在很多物種中都發(fā)現(xiàn)了大量新的ncRNA。 方法 本研究是在鼠疫菌基因組測(cè)序完成的情況下,構(gòu)建鼠疫菌50~400nt sRNA的cDNA文庫(kù),試圖從整個(gè)基因組水平上獲得更多新的、鼠疫菌特異的ncRNA,為其功能研究奠定基礎(chǔ)。本研究旨在鑒定鼠疫菌傳播感染過(guò)程中參與基因調(diào)控的sRNA分子,我們依據(jù)鼠疫菌在傳播和感染過(guò)程中可能面臨的環(huán)境,設(shè)計(jì)并實(shí)施了多個(gè)體外模擬刺激的條件,包括溫度、生長(zhǎng)時(shí)期、鐵缺乏(模擬宿主體內(nèi)低鐵環(huán)境)、低鈣(模擬感染初期III型分泌系統(tǒng)的形成環(huán)境)和低鎂(模擬巨噬細(xì)胞中溶酶體環(huán)境)5種刺激因素,對(duì)5種條件的鼠疫菌總RNA進(jìn)行提取,構(gòu)建鼠疫菌的sRNA cDNA文庫(kù)。我們發(fā)展了一系列先進(jìn)的RNA目標(biāo)片段篩選方法,并將能獲得全長(zhǎng)RNA序列的RACE技術(shù)結(jié)合到cDNA文庫(kù)的構(gòu)建工作中,因此我們的方法更易于獲得真實(shí)的、全長(zhǎng)的sRNA分子。cDNA文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組定位、篩選等一系列深入分析,對(duì)得到的序列進(jìn)行分類,每一類中挑選出有代表性的若干sRNA進(jìn)行Northern Blot和RACE的實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其完整性和真實(shí)存在性,并對(duì)文庫(kù)中得到的70nt以上的sRNA進(jìn)行Real-time PCR的定量分析。最后,通過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)軟件Mfold對(duì)獲得的對(duì)sRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。 結(jié)果 通過(guò)上述RNA組學(xué)的方法和每一步實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控,我們得到了鼠疫菌sRNA文庫(kù)的2540個(gè)有效克隆。與鼠疫菌201株基因組進(jìn)行比對(duì)和定位發(fā)現(xiàn),81.73%的克隆為候選的非編碼RNA,而tRNA和rRNA,分別僅占了2.32%和5.16%,證明了我們通過(guò)磁珠垂釣的方法對(duì)rRNA和干擾序列的去除得到了較理想的效果。通過(guò)進(jìn)一步分析,我們共得到了52個(gè)、7類候選的sRNA分子,其中包括了5個(gè)(9.61%)已知的鼠疫菌sRNA和47個(gè)全新的非編碼RNA(novel sRNA, nosRNA)。這52個(gè)sRNA分子除了兩條的長(zhǎng)度小于50nt外,其余都集中在50~400nt的范圍之內(nèi),而且絕大多數(shù)來(lái)源于鼠疫菌的染色體。我們?cè)诿恳活恠RNA中挑選出具有代表性的sRNA進(jìn)行定性和定量的深入分析。通過(guò)Northern Blot、定量PCR和RACE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,我們實(shí)驗(yàn)中得到的絕大多數(shù)sRNA都是真實(shí)存在的并且基本得到了全長(zhǎng),而且?guī)缀跛械膕RNA在5種條件下都是有表達(dá)并有部分表現(xiàn)出了明顯的表達(dá)差異。此外,通過(guò)對(duì)相鄰基因啟動(dòng)子的敲除實(shí)驗(yàn),我們還證明了一類新的sRNA(UTR sRNA)是獨(dú)立存在的。通過(guò)對(duì)sRNA進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)幾乎所有的sRNA都包含莖-環(huán)的結(jié)構(gòu),且有些自由能較高。 結(jié)論 本研究所用的建庫(kù)方法是可行的,cDNA文庫(kù)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較完整,片段覆蓋的范圍較廣,得到ncRNA在文庫(kù)中所占的比例較大,獲得新ncRNA的效率較高,并且得到的序列大都是真實(shí)可信的。盡管我們給出的鼠疫菌sRNA的信息還不全面,而且還有賴于后續(xù)研究的補(bǔ)充甚至更正,但仍然為鼠疫菌基因sRNA的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及基因功能的預(yù)測(cè)方面邁出了關(guān)鍵的一步。
[Abstract]:Background Non - coding RNA ( ncRNA ) plays an irreplaceable role in regulating the growth , development and adaptation of organisms . method In this study , we have developed a series of advanced RNA target fragment screening methods , including temperature , growth period , iron deficiency ( simulated host low iron environment ) , low calcium ( simulated infection initial stage III secretion system formation environment ) and low magnesium ( simulated macrophage lysosomal environment ) . Results By means of the above - mentioned method and strict quality control , 2540 effective clones of sRNA library were obtained . The results showed that 80.73 % of the clones were non - coding RNAs , while tRNA and rRNA accounted for only 2 . 32 % and 5 . 16 % , respectively , which proved that we obtained 52 , 7 - class sRNA molecules , including 5 ( 9.61 % ) known sRNA and 47 new non - coding RNAs ( novel sRNA , nosRNA ) . In addition , by means of Northern Blot , quantitative PCR and RACE experiments , we have shown that the majority of sRNA from our experiments is truly present and has a significant difference in expression . In addition , by means of Northern Blot , quantitative PCR , and RACE results , we prove that the majority of sRNA in our experiments are truly present and have a partial expression difference . In addition , by analyzing the secondary structure of sRNA , it is found that almost all sRNA contains stem - ring structure , and some free energy can be higher . Conclusion The cDNA library is relatively complete , the coverage of the fragments is relatively complete , the proportion of the ncRNA in the library is relatively large , the efficiency of the new ncRNA is high , and the obtained sequence is mostly true and authentic . Although the information about the sRNA of the plague bacterium is not comprehensive , it also depends on the supplement and even correction of the follow - up study , but it is still a key step in the discovery of the gene sRNA and the construction of the regulatory network and the prediction of gene function .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陸勇軍 ,周惠 ,周惟欣 ,朱遠(yuǎn)琪 ,屈良鵠;A novel snoRNA gene cluster in yeast is transcribed as polycistronic pre-snoRNAs[J];Science in China(Series C:Life Sciences);1999年05期

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本文編號(hào)：1506173