本文關(guān)鍵詞： 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征 肺纖維化 RNA 干擾 轉(zhuǎn)化生長因子 β1 βⅠ型受體　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：構(gòu)建針對轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體（TGFβRⅠ）的RNA干擾（RNAi）慢病毒載體，通過感染人胚肺成纖維細胞株MRC-5，，觀察TGFβRⅠ表達受抑制后，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對MRC-5細胞的增殖、細胞周期、活化、膠原表達以及炎性因子（TNF-α）釋放的影響。 方法：(1)根據(jù)人TGFβRⅠ基因編碼序列設(shè)計4個小干擾序列和1個陰性對照序列，BLAST驗證基因同源性。將設(shè)計的干擾序列合成相應(yīng)的寡核苷酸DNA，退火形成雙鏈后與經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pMagic4.0/EGFP載體連接，PCR行陽性克隆篩選并予以測序鑒定，然后進行慢病毒包裝。(2)將4對TGFβRⅠ-siRNA重組慢病毒載體和1對陰性對照慢病毒載體感染體外培養(yǎng)的MRC-5細胞，感染48h和72h后分別采用Real time PCR和Western blot檢測TGFβRⅠmRNA和蛋白表達。(3)將干擾效率最高的TGFβRⅠ-siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒感染MRC-5細胞48h，之后實驗分為4個組：CON組（MRC-5予以DMEM正常培養(yǎng)），T組（MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激），NC+T組（感染陰性對照慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激）和RNAi+T組（感染TGFβRⅠ-siRNA慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激）。采用MTT法觀察各組細胞的增殖狀態(tài)，流式細胞儀檢測細胞周期時相分布，天狼猩紅染色法測定細胞內(nèi)總膠原含量，RT-PCR檢測各組細胞α-SMA的mRNA表達情況，ELISA法檢測各組細胞上清液中TNF-α表達水平。 結(jié)果：(1)經(jīng)PCR鑒定以及測序結(jié)果證實，成功構(gòu)建TGFβRⅠ基因特異性siRNA慢病毒載體。(2)倒置熒光顯微鏡顯示各感染組細胞發(fā)出綠色熒光，當感染復(fù)數(shù)（MOI）為30、加入Polybrene5ng/ml時，MRC-5細胞感染病毒的效率達93%。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，TGFβRⅠ-siRNA1~4感染組TGFβRⅠmRNA表達水平較正常對照組分別下降了26.8%、80.8%、70.7%和79.7%（P0.05），其中以TGFβRⅠ-siRNA2的干擾效率最高。Western blot檢測結(jié)果顯示抑制TGFβRⅠ蛋白表達下降趨勢與Real-time PCR結(jié)果一致。(3)MTT法和流式細胞儀檢測顯示，與其他各組比較，RNAi+T組細胞增殖受到顯著抑制，RNAi可使細胞周期阻滯于G0/G1期，進入S期細胞比例減少（P0.05），而其他三組之間細胞的增殖能力和周期分布無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。(4)天狼猩紅染色法檢測顯示，與CON組比較，T組和NC組則細胞內(nèi)膠原表達明顯增加(P0.05)；RNAi+T組與T組比較，細胞內(nèi)總膠原表達明顯降低(P0.05)。(5) RT-PCR檢測顯示，與CON組比較，T組和NC組細胞內(nèi)α-SMAmRNA表達明顯增加(P0.05)，而與T組比較，TGFβRⅠ基因RNAi能夠顯著抑制細胞內(nèi)α-SMA mRNA表達(P0.05)。(6)ELISA檢測顯示T組細胞上清液中TNF-α含量高于CON組(P0.05)，RNAi+T組則可降低TGF-β1刺激后細胞TNF-α的濃度升高(P0.05)。 結(jié)論：(1)針對TGFβRⅠ基因特異性siRNA慢病毒載體能夠顯著抑制靶基因的表達；(2)抑制TGFβRⅠ基因表達后，MRC-5細胞增殖受抑制，細胞內(nèi)DNA合成下降，其生長停滯于G0/G1期；(3)慢病毒介導(dǎo)的TGFβRⅠ基因RNAi能夠抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細胞活化、膠原合成和炎性因子（TNF-α）釋放。
[Abstract]:Aim: to construct the RNA interference RNAi lentivirus vector targeting transforming growth factor 尾 I receptor TGF- 尾 R 鈪

本文編號：1498208