本文關鍵詞： 心房肌 Cav1.3 Snapin 膜轉運　出處：《南京師范大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：心肌細胞膜上存在著兩種不同電流特性的的鈣通道：L型和T型。與T型鈣通道相比,L型鈣通道具有大電導、高電壓激活、長時間開放,能和多種拮抗劑作用的特點。就功能而言,L型鈣通道電流(ICa-L)不僅參與心肌動作電位平臺期的形成和維持,而且在心肌興奮-收縮偶聯中起著極為重要的作用。已知,在哺乳類組織,編碼L型Ca2+通道a1亞基的基因有4種,分別是Cavl.1、 Cavl.2、Cav1.3、Cav1.4.最初人們認為心臟中的LVCC僅包括Cav1.2,但后來發(fā)現Cav1.3在心臟中也有表達,并且優(yōu)勢表達于竇房結、房室結和心房,Cavl3基因敲除小鼠表現出竇性心動過緩和房室傳導阻滯,所有這些都表明其在維持正常的心臟節(jié)律中發(fā)揮著至關重要的作用。但是,關于Cav1.3鈣離子通道調節(jié)機制目前所知甚少。 本實驗室用Cavl.3位于胞內的C末端為誘餌,利用酵母雙雜交方法從人心臟cDNA文庫中篩選出了一種新型相互作用蛋白Snapin,一種廣譜表達、在SNARE介導的膜融合過程起輔助作用的小分子蛋白。在本研究中,利用過表達Cav1.3與Snapin的HEK293細胞及小鼠的心房組織進行免疫共沉淀實驗結果表明,二者的相互作用不僅存在于體外異源表達系統(tǒng),而且也存在于心房肌細胞；免疫細胞化學實驗證實,二者無論在過表達Cavl.3與Snapin的HEK293細胞還是小鼠心房肌細胞膜上都存在著共分布。通過設計多個Snapin的片段與Cav1.3的C末端進行GST pull down實驗,確定了Snapin C末端的coil-coil domain是負責與Cavl.3結合的區(qū)域。利用全細胞膜片鉗技術在過表達Cavl.3與Snapin的HEK293細胞記錄鈣離子電流(ICa-L)的結果表明,Snapin顯著地抑制ICα-L密度。進一步經過一系列的生物化學分析發(fā)現,過表達Snapin不僅使定位于細胞膜上的Cav1.3鈣通道數目減少,而且使Cav1.3蛋白總體表達量下降；這一結果在免疫熒光染色檢測中得到進一步印證：在過表達Snapin的HEK293細胞,膜分布減少的Cav1.3均勻分布在胞質中,并與內質網共定位,但與單獨表達Cavl.3鈣通道的細胞相比,這種共定位信號明顯減弱。此外,本研究發(fā)現,過表達Snapin對Cav1.3mRNA表達水平沒有影響,但顯著加速Cavl.3的泛素化降解過程,蛋白酶體抑制劑MG132處理可以顯著逆轉其降解,說明Snapin不影響Cavl.3通道蛋白的合成,而加速其通過蛋白酶體的降解。有趣的是,本研究還發(fā)現,Snapin和Cav1.3還與另外一種SNARE成員SNAP-23形成三維復合物,這種蛋白是一種廣泛表達的SNAP-25的同源物。結果顯示隨著Snapin表達量的增加,SNAP-23與Cav1.3結合的量逐漸減少,提示Cavl.3鈣通道的內質網轉出受到Snapin與SNAP-23親和能力的雙重調控。 綜上所述,本研究首次證明Snapin競爭性地干擾SNAP-23結合Cav1.3的C末端,由此導致Cav1.3的內質網滯留以及隨后的通過蛋白酶體的泛素化降解,而這正是過表達Snapin引起Cav1.3蛋白表達總量和膜表達量下降的直接原因。Snapin如何與SNAP-23協調作用實現其對Cav1.3鈣離子通道生物學功能的調節(jié)有待進一步深入研究。
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【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2;Q78

【參考文獻】

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本文編號：1498100