本文關(guān)鍵詞： 心房肌 Cav1.3 Snapin 膜轉(zhuǎn)運　出處：《南京師范大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：心肌細胞膜上存在著兩種不同電流特性的的鈣通道：L型和T型。與T型鈣通道相比,L型鈣通道具有大電導(dǎo)、高電壓激活、長時間開放,能和多種拮抗劑作用的特點。就功能而言,L型鈣通道電流(ICa-L)不僅參與心肌動作電位平臺期的形成和維持,而且在心肌興奮-收縮偶聯(lián)中起著極為重要的作用。已知,在哺乳類組織,編碼L型Ca2+通道a1亞基的基因有4種,分別是Cavl.1、 Cavl.2、Cav1.3、Cav1.4.最初人們認為心臟中的LVCC僅包括Cav1.2,但后來發(fā)現(xiàn)Cav1.3在心臟中也有表達,并且優(yōu)勢表達于竇房結(jié)、房室結(jié)和心房,Cavl3基因敲除小鼠表現(xiàn)出竇性心動過緩和房室傳導(dǎo)阻滯,所有這些都表明其在維持正常的心臟節(jié)律中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但是,關(guān)于Cav1.3鈣離子通道調(diào)節(jié)機制目前所知甚少。 本實驗室用Cavl.3位于胞內(nèi)的C末端為誘餌,利用酵母雙雜交方法從人心臟cDNA文庫中篩選出了一種新型相互作用蛋白Snapin,一種廣譜表達、在SNARE介導(dǎo)的膜融合過程起輔助作用的小分子蛋白。在本研究中,利用過表達Cav1.3與Snapin的HEK293細胞及小鼠的心房組織進行免疫共沉淀實驗結(jié)果表明,二者的相互作用不僅存在于體外異源表達系統(tǒng),而且也存在于心房肌細胞；免疫細胞化學(xué)實驗證實,二者無論在過表達Cavl.3與Snapin的HEK293細胞還是小鼠心房肌細胞膜上都存在著共分布。通過設(shè)計多個Snapin的片段與Cav1.3的C末端進行GST pull down實驗,確定了Snapin C末端的coil-coil domain是負責(zé)與Cavl.3結(jié)合的區(qū)域。利用全細胞膜片鉗技術(shù)在過表達Cavl.3與Snapin的HEK293細胞記錄鈣離子電流(ICa-L)的結(jié)果表明,Snapin顯著地抑制ICα-L密度。進一步經(jīng)過一系列的生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn),過表達Snapin不僅使定位于細胞膜上的Cav1.3鈣通道數(shù)目減少,而且使Cav1.3蛋白總體表達量下降；這一結(jié)果在免疫熒光染色檢測中得到進一步印證：在過表達Snapin的HEK293細胞,膜分布減少的Cav1.3均勻分布在胞質(zhì)中,并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位,但與單獨表達Cavl.3鈣通道的細胞相比,這種共定位信號明顯減弱。此外,本研究發(fā)現(xiàn),過表達Snapin對Cav1.3mRNA表達水平?jīng)]有影響,但顯著加速Cavl.3的泛素化降解過程,蛋白酶體抑制劑MG132處理可以顯著逆轉(zhuǎn)其降解,說明Snapin不影響Cavl.3通道蛋白的合成,而加速其通過蛋白酶體的降解。有趣的是,本研究還發(fā)現(xiàn),Snapin和Cav1.3還與另外一種SNARE成員SNAP-23形成三維復(fù)合物,這種蛋白是一種廣泛表達的SNAP-25的同源物。結(jié)果顯示隨著Snapin表達量的增加,SNAP-23與Cav1.3結(jié)合的量逐漸減少,提示Cavl.3鈣通道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)出受到Snapin與SNAP-23親和能力的雙重調(diào)控。 綜上所述,本研究首次證明Snapin競爭性地干擾SNAP-23結(jié)合Cav1.3的C末端,由此導(dǎo)致Cav1.3的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留以及隨后的通過蛋白酶體的泛素化降解,而這正是過表達Snapin引起Cav1.3蛋白表達總量和膜表達量下降的直接原因。Snapin如何與SNAP-23協(xié)調(diào)作用實現(xiàn)其對Cav1.3鈣離子通道生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)有待進一步深入研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2;Q78

【參考文獻】

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本文編號：1498100