本文關(guān)鍵詞： 慢病毒載體 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 再狹窄　出處：《青島大學(xué)》2012年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的包裝增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的表達(dá)hBax和hHGF雙基因的慢病毒載體,觀察慢病毒感染后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的影響。 方法通過(guò)重疊PCR技術(shù)和gateway technology技術(shù)構(gòu)建攜帶目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒和僅攜帶綠色熒光蛋白的陰性質(zhì)粒并測(cè)序,上述兩種質(zhì)粒分別和輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝病毒,利用熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)病毒滴度。本實(shí)驗(yàn)選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)作為研究的目的細(xì)胞,利用包裝成功的慢病毒感染目的細(xì)胞,根據(jù)對(duì)目的細(xì)胞的處理不同,試驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(感染了攜帶Bax和HGF雙目的基因的慢病毒)、陰性對(duì)照組(感染了僅攜帶有綠色熒光蛋白的慢病毒)和空白組(未做任何處理的正常細(xì)胞)3組。RT-PCR和Western blot檢測(cè)染毒后各組細(xì)胞Bax和HGF的表達(dá)情況；在倒置顯微鏡下面觀察3組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上所發(fā)生的變化；MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞間的增殖能力是否有差異,細(xì)胞劃痕法觀察HUVEC染毒后遷移能力的變化。 結(jié)果經(jīng)鑒定慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功,利用熒光顯微鏡測(cè)得hBax和hHGF共表達(dá)慢病毒和僅表達(dá)綠色熒光蛋白的陰性病毒滴度分別為7.8×107TU/ml和9x107TU/ml。 RT-PCR和western blot結(jié)果顯示染毒后使HUVEC表達(dá)HGF并且上調(diào)了Bax基因的表達(dá)(P0.05)。倒置顯微鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或者不規(guī)則的多角形,細(xì)胞表面的突起增多；實(shí)驗(yàn)組較之其他兩組細(xì)胞,其增殖能力和遷移能力都明顯的提高(P0.05)。NIH3T3細(xì)胞和HELF染毒后,RT-PCR和western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與其他兩組相比,Bax和HGF的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)；倒置顯微鏡下可見(jiàn)陰性對(duì)照組的細(xì)胞與空白組的細(xì)胞生長(zhǎng)正常。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在染毒72h后,部分細(xì)胞發(fā)生皺縮,體積縮小;96h后可見(jiàn)有部分貼壁細(xì)胞脫落；MTT結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較之其他兩組細(xì)胞,感染hBax和hHGF雙基因共表達(dá)慢病毒后的上述兩種細(xì)胞增殖明顯被抑制(P0.05)。 結(jié)論 ①慢病毒包裝成功,并且獲得了具有較高滴度的慢病毒感染液。 ②Bax和hHGF雙基因共表達(dá)慢病毒成功感染目的細(xì)胞并有效表達(dá),HUVEC染毒后的增殖和遷移能力顯著提高。染毒后的NIH3T3細(xì)胞和HELF增殖被明顯抑制。
[Abstract]:Objective To observe the effect of slow virus infection on endothelial cells and fibroblasts by packaging the slow viral vectors expressing hBax and hHGF double genes . Methods Human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) , human embryonic lung fibroblasts ( HELF ) and mouse embryonic fibroblasts ( NIH 3T3 cells ) were transfected with 293 FT cells . The expression of Bax and HGF was detected by RT - PCR and Western blot . Results The expression of hBax and hHGF was 7.8 脳 107TU / ml and 9x107TU / ml respectively . The results of RT - PCR and western blot showed that the expression of HGF was increased and the expression of Bax gene was up - regulated in the experimental group ( P0.05 ) . Conclusion ( 1 ) The slow virus packaging was successful and a slow virus infection solution with higher titer was obtained . ( 2 ) Both Bax and hHGF co - expressed lentivirus successfully infect the target cells and effectively express , the proliferation and migration ability of HUVEC were significantly improved after exposure to the virus . The proliferation of NIH 3T3 cells and HELF cells was inhibited significantly .

【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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1 李珂;hBax和hHGF雙基因共表達(dá)慢病毒的構(gòu)建及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的影響[D];青島大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1487658