本文關(guān)鍵詞： 結(jié)核分枝桿菌 肺外結(jié)核 基因分型 表達(dá)譜芯片　出處：《北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多年來的研究結(jié)果表明,在人體固有免疫系統(tǒng)中,巨噬細(xì)胞是針對結(jié)核分枝桿菌最重要的細(xì)胞類型。巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌感染的整個(gè)過程有著密切的關(guān)系,包括對于結(jié)核分枝桿菌的識(shí)別,控制以及殺滅等。近年的一些研究成果顯示,在結(jié)核分枝桿菌的干擾與改造下,巨噬細(xì)胞有可能變作其逃避免疫反應(yīng)的避風(fēng)港,為其在人體內(nèi)提供生存所需的能量和空間,甚至是為其播散提供載體。鑒于此,本課題首先選擇了巨噬細(xì)胞作為研究對象,旨在通過對比肺結(jié)核病灶組織與周圍正常肺組織之間巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異,來探明在結(jié)核分枝桿菌感染肺組織的過程中,巨噬細(xì)胞里到底有哪些基因的表達(dá)受到了影響,并尋找到特異性的與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)的基因。此外,大多數(shù)的肺結(jié)核患者只需進(jìn)行內(nèi)科治療,不會(huì)形成諸如厚壁空洞、結(jié)核球、損毀肺等需要外科手術(shù)清除的嚴(yán)重病灶。因此,我們擬通過本次實(shí)驗(yàn)尋找到與這些嚴(yán)重的結(jié)核病灶形成相關(guān)的基因,來初步探明這些嚴(yán)重結(jié)核病灶的形成機(jī)制,為開發(fā)相關(guān)手段阻止疾病的惡化提供依據(jù)。 但在對肺結(jié)核組織標(biāo)本進(jìn)行處理、分選其中的巨噬細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),由于每一個(gè)肺結(jié)核病人的病程、用藥種類、治療時(shí)間等等的不同,造成每一份肺組織標(biāo)本之間都存在很大差異,不像使用動(dòng)物模型時(shí)能夠獲得大致相同的病例標(biāo)本。另外,由于缺少標(biāo)準(zhǔn)的使用人肺組織制備單細(xì)胞懸液的試驗(yàn)方法,使得我們在制備肺組織單細(xì)胞懸液時(shí)困難重重,無法通過統(tǒng)一的分選方法獲得病灶組織與正常組織中的巨噬細(xì)胞。所以我們暫時(shí)改變實(shí)驗(yàn)策略,直接使用病灶組織和正常組織來進(jìn)行基因表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn),這樣獲得的結(jié)果更能全面地反應(yīng)肺組織的免疫狀態(tài)。同時(shí)也可以將其中與巨噬細(xì)胞相關(guān)的數(shù)據(jù)拿出,再做深入研究。 通過對肺組織芯片結(jié)果的分析,我們發(fā)現(xiàn)正常組織相對病灶組織來說基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)2倍以上的個(gè)數(shù)分別為332個(gè)和102個(gè),進(jìn)一步增大篩選標(biāo)準(zhǔn)至4倍,則上調(diào)和下調(diào)的個(gè)數(shù)分別為19個(gè)和2個(gè)。兩個(gè)表達(dá)量下調(diào)4倍的基因分別為FER1L4、PPIL5。在19個(gè)表達(dá)量上調(diào)4倍以上的基因中,AREG基因的差異表達(dá)倍數(shù)更大,在三組平行實(shí)驗(yàn)中均達(dá)到了11倍以上。另外,細(xì)胞因子TNF和肺結(jié)核病灶內(nèi)肉芽腫的形成和解散有關(guān),因此我們將差異表達(dá)基因內(nèi)與TNF相關(guān)的一些數(shù)據(jù)單獨(dú)拿出,發(fā)現(xiàn)有4個(gè)基因表達(dá)量在正常組織內(nèi)明顯上調(diào)。因此,我們認(rèn)為以上這些基因,尤其是PPIL5,AREG以及TNF,由于受到結(jié)核分枝桿菌的影響,表達(dá)量發(fā)生了變化,從而導(dǎo)致肺組織內(nèi)嚴(yán)重結(jié)核病灶的形成。 此外,我們還比較了肺結(jié)核手術(shù)病人在手術(shù)前后,外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)基因表達(dá)譜的差異。我們使用密度梯度離心的方法,將肺結(jié)核病人手術(shù)前后血標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞分離出來,繼而進(jìn)行表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)。通過本實(shí)驗(yàn),我們想初步了解在手術(shù)去除結(jié)核病灶,也即去除絕大部分結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷后,機(jī)體的免疫反應(yīng)到底發(fā)生了哪些變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,術(shù)后PBMC中有38種基因上調(diào)表達(dá)2倍以上,91中基因下調(diào)表達(dá)2倍以上。當(dāng)我們將篩選標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)大到4倍時(shí),則找不到符合標(biāo)準(zhǔn)的基因。因此,我們又將篩選標(biāo)準(zhǔn)定在兩者之間(3倍),結(jié)果顯示有6中基因下調(diào)表達(dá),2種基因上調(diào)表達(dá)。我們對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),他們與針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)并無明顯聯(lián)系。這樣的結(jié)果使我們認(rèn)為以外周血細(xì)胞為代表的全身免疫反應(yīng)在應(yīng)對結(jié)核分枝桿菌時(shí)可能不會(huì)起到關(guān)鍵性的作用。 我們還對小樣本量的肺外結(jié)核(骨結(jié)核)臨床分離菌株基因分型的特點(diǎn)進(jìn)行了初步研究,以了解肺外結(jié)核與肺結(jié)核的致病菌在基因分型方面的差異,為探討肺結(jié)核與肺外結(jié)核之間的關(guān)系積累數(shù)據(jù),并為臨床針對肺結(jié)核與肺外結(jié)核的差異化治療提供相關(guān)依據(jù)。 我們利用間隔區(qū)寡核苷酸(Spoligotyping)分型法和數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(VNTR)分型法分別對肺結(jié)核與肺外結(jié)核的臨床分離菌株進(jìn)行分型,并與國際通行的結(jié)核分枝桿菌分型數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比,從而確定每株結(jié)核分枝桿菌的基因型。Spoligotyping分型結(jié)果顯示,在14株肺結(jié)核臨床分離菌株中有9株為Beijing基因型,2株為T2基因型,另外3株分別為MANU2型、Haaslem3型以及未命名型(結(jié)果可表示為:777777001760771)。14株肺外結(jié)核臨床分離菌株Spoligotyping分型結(jié)果則高度一致,均可表示為777777777777771,為未命名型。VNTR實(shí)驗(yàn)得出了類似的結(jié)論,12個(gè)VNTR位點(diǎn)可將14株肺結(jié)核臨床分離菌株完全區(qū)別開來,形成完全不同的14個(gè)基因型,而肺外結(jié)核臨床分離菌株每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小都完全相同,具有100%的成簇率。 通過對肺結(jié)核與肺外結(jié)核臨床分離菌株基因分型結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)兩者差異巨大,在肺結(jié)核中流行的菌株主要為Beijing基因型,約占65%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的在肺結(jié)核臨床分離菌株中Beijing基因型占70%基本一致。但肺外結(jié)核臨床分離株中有100%的分型一致性和成簇率,而且這一基因型并非是在中國流行最為廣泛的北京基因型或其亞型。因此我們認(rèn)為在肺外結(jié)核中,這一基因型別的結(jié)核分枝桿菌可能占據(jù)主要地位,較之其他更易引起肺外組織,尤其是骨組織的病變。
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【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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1 李衛(wèi)民,王蘇民,裴秀英,劉忠泉,鐘球,錢明,趙冰,端木宏謹(jǐn);北京、廣東、寧夏三地結(jié)核分支桿菌DNA指紋的應(yīng)用研究[J];中華流行病學(xué)雜志;2003年05期

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本文編號(hào)：1479855