本文關(guān)鍵詞： 香港海鷗菌 卵黃抗體 多克隆抗體 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 體外抑菌實(shí)驗(yàn)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 香港海鷗菌(Laribacter hongkongensis, LH),最早在2001年由香港大學(xué)微生物學(xué)專家Yuen等[1]白一名肝硬化病人的胸腔積膿和血液中分離得到,通過(guò)生化特性和16S rRNA基因序列等分析,發(fā)現(xiàn)該菌有別于其他細(xì)菌種屬,屬新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌菌屬。2004年香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系Woo等[2,3]發(fā)表在國(guó)際權(quán)威醫(yī)學(xué)雜志《Lancet》上的一項(xiàng)最新研究成果,研究人員通過(guò)一個(gè)多中心的病例對(duì)照研究提出香港海鷗形菌可能與社區(qū)獲得性胃腸炎和旅行者腹瀉有關(guān),有食用淡水魚與外出旅游的經(jīng)歷是該類腹瀉的主要危險(xiǎn)因素,研究還提出淡水魚是香港海鷗型菌的宿主之一。香港海鷗型菌作為一種新發(fā)現(xiàn)的食源性病原菌,目前尚未有一套關(guān)于該菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。該菌的檢測(cè)方法目前主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、PCR鑒定、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)等方法[1,4-6],尚未有香港海鷗菌免疫學(xué)檢測(cè)方法的報(bào)道。 禽類血液中的免疫球蛋白IgG可轉(zhuǎn)移到卵黃液中,并且在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)潛在的病原體感染起到被動(dòng)保護(hù)作用[7],這種免疫球蛋白稱為卵黃免疫球蛋白--IgY。IgY是存在于雞卵黃中的主要免疫球蛋白,屬多克隆抗體,IgY在疾病的診斷和防治方面具有許多特定優(yōu)點(diǎn)。通常通過(guò)血清途徑一次性大量制備抗體是相當(dāng)困難的,而且多次制備,又導(dǎo)致抗體的均一性差。母雞一經(jīng)免疫應(yīng)答后,可從其卵黃中不斷獲得特異性的抗體。IgY具有純度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),不與哺乳動(dòng)物產(chǎn)生交叉血清反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng),可作為替代免疫小鼠、兔等哺乳動(dòng)物所制備的抗體而大量生產(chǎn)。近年來(lái),IgY的研究和應(yīng)用是免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和十分活躍的課題。本文用香港海鷗型菌作為抗原免疫蛋雞制備抗香港海鷗菌卵黃抗體,并對(duì)其理化性質(zhì)、免疫原性、抑菌生物學(xué)活性進(jìn)行了研究,為其今后在診斷和疾病防治方面的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。 研究目的和內(nèi)容 1.制備抗香港海鷗菌特異性卵黃抗體。 2.建立直接ELISA法檢測(cè)LH的初篩方法并對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 3.初步探索抗香港海鷗菌卵黃抗體的體外抑菌效果。 方法： 1.制備香港海鷗菌菌體抗原,腋下肌肉多點(diǎn)注射免疫海蘭白雞,收集免疫雞蛋,分離提取抗香港海鷗菌卵黃抗體。 2.采用抗原吸收法,飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法純化多克隆抗體。 3.間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià),用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白含量,采用SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度。 4.利用上述獲得的卵黃抗體結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記技術(shù)建立檢測(cè)香港海鷗菌的直接ELISA法。 5.用建立的直接ELISA方法檢測(cè)草魚腸道及虎紋蛙腸道分離的標(biāo)本,評(píng)價(jià)該方法的靈敏度和特異度。 6.利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,比濁法檢測(cè)其抑制香港海鷗菌生長(zhǎng)的效果。 結(jié)果： 1.飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法純化抗體,抗體效價(jià)可達(dá)到1：128000左右；抗香港海鷗菌卵黃抗體對(duì)傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌存在交叉反應(yīng),采用抗原吸收法吸收后,抗體的效價(jià)下降至1：8000；卵黃抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定,雜帶少,純度較好,條帶主要集中于60KD和30KD附近。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色法得到每毫升的卵黃液中卵黃抗體蛋白濃度為7-10mg。 2.獲得的IgY抗體具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿度耐受性。 3.利用過(guò)碘酸鈉對(duì)卵黃抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,建立HRP-IgY酶標(biāo)抗體的直接ELISA法檢測(cè)香港海鷗菌,封閉時(shí)間為60mim,最佳酶標(biāo)抗體稀釋滴度為1：160,陽(yáng)性檢測(cè)限為X+3SD=0.181,最低檢測(cè)限香港海鷗菌濃度為106cfu/ml。 4.利用建立的HRP-IgY酶標(biāo)抗體直接ELISA法檢測(cè)自淡水產(chǎn)品腸道分離的細(xì)菌,靈敏度為90%,特異度91.5%,為香港海鷗菌檢測(cè)方法提供新的備選方法。 5.經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)初步證明15mg/ml IgY的抗體濃度對(duì)106cfu/ml香港海鷗菌的生長(zhǎng)具有抑制作用,其活性及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。 結(jié)論： 1.利用改良水稀釋法結(jié)合硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)卵黃抗體進(jìn)行分離純化,得到的抗體純度和活性良好。 2.利用過(guò)碘酸鈉對(duì)卵黃抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,建立HRP-IgY酶標(biāo)抗體的直接ELISA法檢測(cè)香港海鷗菌,該方法具有可操作性,為香港海鷗菌的檢測(cè)方法提供了新的想法和思路。 3.經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)初步證明該抗體對(duì)香港海鷗菌的生長(zhǎng)具有抑制作用,但其活性及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378;R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 常山,張雅萍,肖光夏;抗白色念珠菌IgY的穩(wěn)定性與應(yīng)用研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年12期

2 郎婧;金敏;王新為;李君文;晁福寰;;大腸桿菌O157:H7多克隆抗體純化[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年04期

3 張煒明;吳玉龍;劉文琪;仇鎮(zhèn)寧;馮振卿;李雍龍;管曉虹;;卵黃抗體IgY檢測(cè)血吸蟲病人循環(huán)抗原的初步研究[J];中國(guó)血吸蟲病防治雜志;2008年01期

4 朱敏;朱水榮;梅玲玲;金大智;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于香港海鷗形菌的檢測(cè)鑒定[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2009年10期

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本文編號(hào)：1478680