本文關(guān)鍵詞： 異體組織移植 基因治療 共刺激信號 OX40Ig CTLA4Ig　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 探討重組lvOX40Ig和lvCTLA4Ig局部轉(zhuǎn)染同種異體復(fù)合組織移植阻斷共刺激途徑，觀測目的基因在同種異體復(fù)合組織移植后對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，以及局部表達(dá)OX40Ig和CTLA4Ig發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。 方法: 構(gòu)建了重組慢病毒載體OX40Ig和CTLA4Ig，體外同種異體復(fù)合組織局部目的基因轉(zhuǎn)染，使移植物局部能夠分泌OX40Ig和CTLA4Ig融合蛋白。檢驗(yàn)慢病毒載體目的基因在293細(xì)胞的表達(dá)，驗(yàn)證其構(gòu)建是否成功。采用近交系大鼠下腹壁淺動(dòng)脈皮瓣移植模型，檢驗(yàn)lvOX40Ig和lvCTLA4Ig介導(dǎo)的目的基因局部表達(dá)對阻斷OX40/OX40L以及CD28/B7共刺激途徑、延長移植物存活時(shí)間的作用。實(shí)驗(yàn)分為6組，組Ⅰ：未處理組；組Ⅱ：LvEGFP組；組Ⅲ：小劑量雷帕霉素治療組；組Ⅳ：LvOX40Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素組；組Ⅴ：LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素組；組Ⅵ：LvOX40Ig+LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素治療組。比較各組移植物成活狀況。檢驗(yàn)其在移植物以及全身中的表達(dá)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢驗(yàn)其免疫調(diào)節(jié)活性。檢測移植后各組免疫細(xì)胞，細(xì)胞因子以及免疫相關(guān)趨化因子的變化。 結(jié)果： 體外轉(zhuǎn)染LvOX40Ig和LvCTLA4Ig后，單一雷帕霉素治療相比較空白對照組移植物存活時(shí)間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單一灌注LvOX40Ig或者LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素治療與空載體病毒組比較能夠顯著延長移植物的存活時(shí)間，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。組織病理學(xué)檢查術(shù)后7天，空載體病毒組與空白對照組符合Banff2007標(biāo)準(zhǔn)的Ⅲ級及以上免疫排斥反應(yīng)，在各個(gè)單一基因聯(lián)合小劑量雷帕霉素組及綜合用藥組的組織切片中可以觀察到移植物存活狀態(tài)顯著提高，顯微鏡下無免疫排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。移植物術(shù)后28天觀察顯示，空白對照組，空載體病毒組以及雷帕霉素組同種異體皮瓣無一存活。剩余三組LvOX40Ig組，LvCTLA4Ig組以及綜合用藥組的皮瓣表現(xiàn)出中等程度淋巴細(xì)胞浸潤。Westernblot以及PCR免疫熒光組織化學(xué)顯示移植物局部目的基因的高表達(dá)，但是內(nèi)臟器官無目的基因表達(dá)，術(shù)后45天仍有目的基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4，CD8細(xì)胞含量以及比值的變化，提示各組與綜合治療組比較CD4+T細(xì)胞含量減低，CD4/CD8比值下降，免疫熒光組織化學(xué)顯示移植物中FOXP3+T細(xì)胞含量顯著上升。ELISA檢測血中各細(xì)胞因子含量顯示綜合治療組IL-2，INF-γ水平下降，IL-4，IL-10水平明顯上升。免疫組織化學(xué)檢測趨化因CCR5的變化，，可見空白對照組中CCR5陽性細(xì)胞數(shù)高于綜合治療組的CCR5陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)表明，OX40Ig以及CTLA4Ig局部基因治療聯(lián)合小劑量的雷帕霉素協(xié)同作用可延長移植物的存活時(shí)間。該方法有效地減小了術(shù)后早期全身免疫抑制劑的用量，為異體復(fù)合組織移植免疫耐受的誘導(dǎo)提供了新方法。
[Abstract]:Objective: Objective: to investigate whether local transfection of recombinant lvOX40Ig and lvCTLA4Ig may block the co-stimulation pathway by allogeneic composite tissue transplantation. Objective to observe the immunomodulatory effect of gene on organism after allogeneic composite tissue transplantation, and to study the mechanism of local expression of OX40Ig and CTLA4Ig. Methods: The recombinant lentivirus vectors OX40Ig and CTLA4 IgG were constructed and transfected with local target gene of allogenic composite tissue in vitro. The fusion protein of OX40Ig and CTLA4Ig could be secreted by the grafts. The expression of the target gene of lentivirus vector in 293 cells was examined. To verify the success of the construction, the model of superficial inferior abdominal artery flap transplantation in inbred rats was used. LvOX40Ig and lvCTLA4Ig mediated local expression of the target gene blocked OX40/OX40L and CD28/B7 costimulatory pathway. The experiment was divided into 6 groups: group 鈪

本文編號：1477157