本文關(guān)鍵詞： 蛙皮素受體亞型-3 蛙皮素受體激活蛋白 氣道高反應(yīng) 抗原呈遞　出處：《中南大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：蛙皮素受體亞型-3(bombesin receptor subtype 3, BRS-3)作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛙皮素樣肽(bombesin-like peptides, BLPs)受體,它與神經(jīng)介素B受體(the neuromedin B receptor, NMBR)、胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor, GRPR)共同組成哺乳動物體內(nèi)的BLPs受體家族,后兩者可分別與NMB、GRP特異性結(jié)合發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。對BRS-3的天然配體的研究,國內(nèi)外至今尚無定論,因而對其基因表達調(diào)控方式、生物學(xué)功能、生物學(xué)意義以及在體內(nèi)的作用方式、途徑所知有限。 本課題組對BRS-3進行了一系列的前期研究,發(fā)現(xiàn)BRS-3可能參與細胞的生長和損傷修復(fù),并可能參與對呼吸道應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控。用細菌雙雜交及免疫共沉淀法還發(fā)現(xiàn)了兩種新基因編碼蛋白,可以與BRS-3發(fā)生相互作用,但是其具體的生物學(xué)功能及意義不清楚。本課題組將其中一種基因庫序列號為NM-152734的新基因編碼蛋白命名為蛙皮素受體激活蛋白(bombesin receptor activated protein, BRAP),并對其進行了基因表達調(diào)控及生物學(xué)功能方面的研究。 生物信息學(xué)研究結(jié)果顯示,BRAP可能是一個信號分子。Northern blot顯示BRAP在臭氧應(yīng)激的動物肺組織中表達升高。亞細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)BRAP在胞膜和胞漿表達豐富,而細胞核內(nèi)基本不表達,提示BRAP可能作為一種胞漿蛋白,參與應(yīng)激條件下應(yīng)激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激條件下某些特定生理功能的調(diào)控。 人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)在應(yīng)激條件下表現(xiàn)的各種應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)主要包括：細胞增殖和修復(fù)、表達粘附分子、與基質(zhì)粘附或白細胞粘附、攝取處理抗原并將相應(yīng)的抗原信息呈遞給淋巴細胞激活免疫應(yīng)答反應(yīng)。BRAP對HBECs增殖和損傷修復(fù)的影響前期已經(jīng)完成,發(fā)現(xiàn)BRAP高表達后可以上調(diào)HBECs的增殖和損傷修復(fù)速度。因此,本課題將主要研究BRAP高表達或沉默后對HBECs抗原呈遞功能的影響,探討B(tài)RAP是否可以通過影響HBECs的抗原呈遞功能從而影響HBECs對炎癥等應(yīng)激的反應(yīng),以及BRAP在氣道高反應(yīng)中可能的作用機制。 目的：通過研究BRAP在臭氧應(yīng)激小鼠肺組織中的定位和表達,為BRAP是否在氣道上皮細胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用提供信息。然后構(gòu)建BRAP高表達穩(wěn)定細胞系、篩選BRAP有效沉默質(zhì)粒并瞬時轉(zhuǎn)染HBECs,研究在BRAP不同表達水平下,HBECs對外源性抗原的攝取能力、HBECs細胞表面MHC-Ⅱ類分子HLA-DR及共刺激分子B7家族中各分子的表達量、HBECs對與之共培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞的增殖和分化的影響。通過以上三個方面研究,對BRAP在HBECs應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)中的影響及BRAP在氣道高反應(yīng)中可能的作用機制進行初步探討。 方法： (1)Real-time PCR法及免疫組織化學(xué)法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測BRAP在臭氧應(yīng)激肺組織中的表達和定位。 (2)構(gòu)建pcDNA3.1(+)/BRAP重組質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空載體質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HBECs,用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。篩選BRAP的有效沉默質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染進HBECs中。采用Real-time PCR法及Western blot法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測各組HBECs中BRAP的表達情況,鑒定BRAP高表達穩(wěn)定細胞系是否構(gòu)建成功,并鑒定BRAP沉默質(zhì)粒的沉默效率。 (3)以FITC-OVA作為一種外源性的抗原,用熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)跟蹤觀察孵育30 min、60 min、90 min后,pcDNA3.1(+)/BRAP高表達HBECs、pcDNA3.1(+)空載體HBECs、正常HBECs三組HBECs對FITC-OVA的攝取情況,以陽性細胞百分率或者細胞內(nèi)平均熒光強度表示FITC-OVA的量,反映BRAP不同表達水平對HBECs攝取外源性抗原能力的影響。 (4)采用Real-time PCR和流式細胞術(shù)檢測BRAP表達水平不同的各組HBECs中HLA-DR和B7家族各分子的表達量,反映BRAP不同表達水平對HBECs表達MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子的影響。 (5)將pcDNA3.1(+)/BRAP高表達組、pcDNA3.1(+)空載體組、BRAP沉默組和陰性對照組HBECs接種6孔板,用1 mg/ml的OVA預(yù)處理2h后,與新鮮分離的人外周血淋巴細胞共培養(yǎng)48h,分別收集淋巴細胞和細胞培養(yǎng)上清液,用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞周期,MTT法測淋巴細胞增殖,ELISA法檢測上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的含量,反映BRAP不同表達水平對淋巴細胞增殖和分化的影響。 結(jié)果： (1)與正常對照組(臭氧攻擊0天)相比,臭氧攻擊2天、4天的昆明小鼠肺組織中BRAP mRNA水平及蛋白水平均明顯升高,BRAP參與支氣管肺組織的應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)。 (2)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體質(zhì)粒的HBECs(?)目比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/BRAP重組質(zhì)粒的HBECs中BRAP mRNA水平及蛋白水平均顯著性升高,BRAP過表達穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功；與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組HBECs相比,轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的HBECs中BRAP mRNA水平及蛋白水平均明顯降低,BRAP干擾質(zhì)�？捎行С聊珺RAP的表達,可用于后續(xù)試驗。 (3)pcDNA3.1(+)/BRAP高表達HBECs、pcDNA3.1(+)空載體HBECs、正常HBECs三組HBECs對FITC-OVA的攝取能力均隨孵育時間的延長而增加,90min達高峰。與相同時間點的pcDNA3.1(+)空載體組HBECs及正常對照組HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表達組HBECs對外源性抗原的攝取能力明顯下降,BRAP高表達抑制HBECs的抗原攝取能力。 (4)與pcDNA3.1(+)空載體組HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表達上調(diào)HBECs中HLA-DR及B7家族各分子的mRNA表達水平,并上調(diào)HLA-DR、B7DC的蛋白表達水平,但下調(diào)CD86、B7-H1蛋白的表達；而與陰性對照組HBECs相比,BRAP沉默上調(diào)HBECs細胞表面CD86的表達。 (5)與pcDNA3.1(+)空載體組HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表達組HBECs抑制與之共培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞的增殖,下調(diào)淋巴細胞周期中S期細胞百分比,上調(diào)G1期細胞百分比；而與陰性對照組HBECs相比,BRAP沉默組HBECs上調(diào)淋巴細胞周期中S期細胞百分比,下調(diào)G1期細胞百分比。 (6)與pcDNA3.1(+)空載體組HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表達抑制淋巴細胞分泌IL-4和IL-17,但對IFN-γ的分泌無明顯影響。而BRAP沉默對淋巴細胞分泌細胞因子無明顯影響,還需加大樣本量。 結(jié)論： (1)臭氧攻擊促進小鼠支氣管肺組織中BRAP的表達,提示BRAP可能參與調(diào)控支氣管肺組織對臭氧攻擊等應(yīng)激應(yīng)答的反應(yīng)并參與應(yīng)激信號的傳遞。 (2)BRAP過表達抑制HBECs對外源性抗原的攝取,通過對MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子表達的調(diào)控,抑制HBECs的抗原呈遞能力,進而抑制淋巴細胞的增殖與分化。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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