發(fā)布時間：2018-01-27 14:39

  本文關鍵詞： HBV RNA干擾 固有免疫 RIG-I PKR　出處：《山東大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的： RNA干擾(RNAi)是植物和低等動物體內發(fā)揮防御內源性核酸的比較保守的機制。內源性的RNAi通路主要通過siRNA和miRNA兩個途徑發(fā)揮作用,而miRNA主要是基因組中非完全匹配的非編碼RNA。 目前,RNAi已被廣泛應用于抗HBV研究中,并在體內外實驗中證實能夠明顯抑制HBV的復制和表達。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)某些siRNA具有免疫激活作用,能被胞內固有免疫受體所識別。機體天然免疫系統(tǒng)主要通過TLRs、PKR、RIG-I等介導對siRNA的識別,進而活化NF-κB、MAPK、IRF-7等信號通路,誘導干擾素和炎性因子的產生。 X基因(HBx)是多功能HBV序列的代表,其編碼的X蛋白是所有轉錄本均具有的保守序列,因此,是進行基因治療的理想靶標。在HBV所引起的慢性乙型肝炎的發(fā)病機制中,既有病毒的始動作用,又有機體固有免疫和獲得性免疫的功能不足,肝臟中HBV的持續(xù)存在可抑制TLRs、RIG-I等介導的天然免疫應答,此亦成為HBV持續(xù)性感染進一步加重肝臟免疫耐受、影響HBV臨床治療效果的原因之一。因此,對慢性乙肝的治療要求兼顧抑制病毒和增強免疫功能。降低HBV負荷的同時提高肝臟微環(huán)境中天然和獲得性免疫應答能力可能會糾正或逆轉HBV導致的免疫耐受。 本研究的目的是通過設計靶向HBx基因的5'-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA)和化學合成siRNA(HBx-siRNA),觀察該siRNA能否既發(fā)揮特異性的靶基因沉默作用,又能夠激活天然免疫相關信號通路,從而改善HBV導致的免疫耐受狀態(tài)。 研究方法： 首先,我們以攜帶HBV全基因組的HepG2.2.15細胞為模型,觀察轉染3p-siRNA對HBV表達和復制的影響及免疫刺激作用。用RT-qPCR的方法檢測了HBx基因和HBs/p基因的表達；用ELISA的方法檢測了HepG2.2.15細胞上清中HBsAg和HBeAg的含量變化。在免疫刺激作用方面,用RT-qPCR的方法檢測了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表達水平；通過Western blotting檢測p42/p44 MAPK信號通路的活化,以及NF-κB信號通路中IKB的蛋白降解水平；應用螢光素酶報告基因實驗觀察3p-HBx-siRNA對IFN-β的啟動子序列的調控。另外,我們比較了HepG2和HepG2.2.15細胞表達相關細胞因子的差別,發(fā)現(xiàn)感染HBV的HepG2.2.15細胞中,RIG-Ⅰ和干擾素相關基因表達相對較低；HepG2細胞對poly I：C刺激的免疫應答效應更為明顯,而HepG2.2.15的反應相對比較遲鈍。這表明,相對于無HBV感染的HepG2細胞,HepG2.2.15細胞處于免疫抑制狀態(tài)。而3p-HBx-siRNA對RIG-Ⅰ信號通路的活化能夠有效逆轉這種免疫耐受狀態(tài)。通過RIG-Ⅰ的過表達以及沉默實驗,我們進一步證實,3p-HBx-siRNA能夠通過活化RIG-Ⅰ信號通路進而增強對HBV復制的抑制作用。 其次,我們將化學合成的siRNA轉染到HepG2.2.15細胞中,進一步驗證了靶向HBx基因的HBx-siRNA對HBV的抑制作用,用RT-qPCR的方法檢測HBx基因以及HBV s/p基因的表達；用ELISA的方法檢測了HepG2.2.15細胞上清中HBsAg和HBeAg的含量變化；通過Western Blotting技術觀察了HBx-siRNA對HepG2.2.15細胞中PKR信號通路的活化作用,用RT-qPCR的方法檢測了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表達水平；通過PKR的過表達實驗和抑制實驗,觀察了胞內干擾素相關基因的變化,并檢測了對HBV復制的影響。 最后,我們通過尾靜脈高壓注射HBV質粒的方式建立小鼠HBV感染模型。一方面,通過灌流法分離小鼠肝實質細胞,然后轉染HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA,觀察其對HBV的抑制作用和免疫激活作用。另一方面,在HBV感染小鼠體內進行HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的治療,觀察其在小鼠體內的免疫激活作用和HBV抑制作用。用放射免疫方法比較了血清中HBsAg和HBeAg的含量變化；用免疫組化的方法檢測了胞內HBcAg的表達；用ELISA法檢測了小鼠血清中IFN-α、IFN-β,以及免疫抑制因子TGF-β和IL-10的含量；用流式細胞術檢測了不同淋巴細胞亞群CD69和NKG2D的表達。 結果一體外試驗證實5'-triphosphate-siRNA能夠逆轉HBV免疫耐受 1.5'-triphosphate-siRNA的體外轉錄以及鑒定 利用T7 RNA聚合酶的體外轉錄方法,我們成功獲得了靶向HBx基因的5'-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA),其序列和化學合成的siRNA相同,見表1和表2。我們還設計了靶向GAPDH以及無關序列的3p-siRNA,即3p-GAPDH-siRNA和3p-scramble-siRNA。 2.非特異性3p-siRNA能夠序列非依賴性引起免疫激活作用 將靶向GAPDH和scramble的3p-siRNA轉染HepG2.1.15細胞,檢測干擾素相關基因的表達,發(fā)現(xiàn)其能激活RIG-Ⅰ通路并誘導干擾素等細胞因子的表達,并在一定程度上抑制HBV的復制。 3.化學合成的siRNA的抗HBV和免疫激活效應 化學合成的HBx-siRNA能夠顯著抑制HBV的復制,但其對Ⅰ型干擾素的誘導能力比較弱,誘導倍數在4-6倍左右。 4.3p-HBx-siRNA的‘'off-target"免疫刺激效應 靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA能夠被胞內RIG-Ⅰ所識別,進而活化下游NF-κB和MAPK信號通路,從而誘導Ⅰ型干擾素和促炎癥因子的表達,并下調免疫抑制因子IL-]0和TGF-β的表達。 5.雙功能3p-HBx-siRNA優(yōu)于單純具基因沉默作用的HBx-siRNA 兼具免疫激活作用和直接HBx沉默作用的3p-HBx-siRNA能夠更加有效地抑制HBx、HBV s/p基因的表達,以及上清中HBsAg和HBeAg的分泌,其抑制HBV的效果要明顯優(yōu)于化學合成HBx-siRNA。 6.3p-HBx-siRNA逆轉HBV免疫耐受 攜帶HBV全基因組的HepG2.2.15細胞本身處于免疫耐受的狀態(tài),且對于polyI:C誘導的應答反應亦不如HepG2細胞敏感。靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA不僅能夠抑制HBV的復制,還能夠激活RIG-Ⅰ免疫信號通路,進一步逆轉HBV誘導的免疫 耐受。 7.3p-HBx-siRNA的免疫刺激作用和RIG-Ⅰ介導的Ⅰ型干擾素有關 過表達RIG-Ⅰ后,3p-HBx-siRNAs的HBV抑制作用更為顯著,并且能夠增強免疫激活作用；RIG-Ⅰ的沉默后,3p-HBx-siRNAs對HBV的抑制作用明顯削弱。這些結果進一步表明,RIG-Ⅰ信號通路活化與HBV抑制有關。而用IFNR1中和抗體將干擾素信號通路阻斷后,3p-HBx-siRNAs對HBx基因的抑制作用明顯削減。 結果二化學合成的HBx-siRNA能夠通過激活PKR信號通路進一步抑制HBV的復制 1. HBx-siRNAs抑制HBV的表達 化學合成的HBx-siRNAs不僅能夠沉默HepG2.2.15細胞HBx基因的表達,還能抑制HBcAg的表達,降低HBsAg和HBeAg的水平,并且這種抑制HBV的效果具有siRNA濃度依賴關系。 2. HBx-siRNAs誘導免疫應答反應 在HepG2.2.15細胞中,化學合成HBx-siRNA可以誘導干擾素效應,并且其誘導效果隨siRNA轉染濃度的升高而增強；HBx-siRNA在誘導干擾素效應的同時,還能引起炎癥因子的分泌；其對趨化因子CXCL2、CCL4、CXCL10的表達并沒有顯著影響。 3. HBx-siRNAs能夠誘導PKR以及下游信號通路的活化 在HepG2.2.15細胞中,化學合成HBx-siRNA可以誘導PKR表達；Western Blotting結果顯示,胞內PKR的磷酸化程度增強,并且能明顯促進PKR底物eIF-2a的磷酸化；這些結果顯示,PKR可能介導了HBx-siRNA所誘導的免疫激活作用。 4.PKR介導HBx-siRNAs誘導的免疫應答 和轉染對照質粒組相比,HepG2.2.15細胞轉染HBx-siRNAs后,過表達PKR可進一步促進IFN-αα和IFN-p mRNA水平的升高。而用2-AP抑制PKR活性后,干擾素和抗病毒基因的表達受到明顯影響。結果提示,PKR的確參與了HBx-siRNAs引起的天然免疫應答。 5.進一步確認PKR活化對于HBV的抑制作用 我們將PKR過表達質粒以及對照質粒轉染HepG2.2.15細胞,進而分析HBV表達的變化,結果發(fā)現(xiàn)HBx和HBs/p表達水平降低,表現(xiàn)出更加顯著的抗HBV效果。而用2-AP抑制PKR后,HBx-siRNA對HBV的抑制效果明顯削減。這些結果說明,PKR的活化能夠有效抑制HBV的復制。 結果三HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA逆轉HBV免疫耐受的體內效應 1.HBV持留續(xù)存(免疫耐受)小鼠模型的建立 通過尾靜脈高壓注射的方式成功建立了HBV慢性感染模型,HBV感染比例大約為80%左右。 2.3p-HBx-siRNA對HBV免疫耐受小鼠肝實質細胞的抗病毒效應 膠原酶灌流法提取分離HBV慢性感染小鼠體內肝實質細胞；HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能抑制HBV基因的表達,從而抑制HBV的復制；均能明顯上調RIG-Ⅰ的表達和Ⅰ型干擾素的產生。 3.雙功能3p-HBx-siRNA對HBV免疫耐受小鼠肝實質細胞的HBV抑制效應 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA轉染小鼠肝實質細胞可明顯抑制HBx和HBsAg的基因表達,降低血清中HBsAg和HBeAg的水平,抑制胞內HBcAg的表達,而以3p-HBx-siRNA的作用更明顯。 4. HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA在HBV免疫耐受小鼠體內的免疫激活效應 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能明顯誘導HBV免疫耐受小鼠IFN-α和IFN-β的分泌,降低血清中TGF-β和IL-10的含量。HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治療對小鼠肝臟和脾臟淋巴細胞的比例并沒有顯著影響；3p-HBx-siRNA治療可明顯增強肝臟T細胞、NKT細胞CD69的表達；HBx-siRNA能明顯上調肝臟T細胞和脾臟NK細胞CD69的表達；3p-HBx-siRNA治療可略提高肝臟NKT細胞和NK細胞NKG2D的表達,而HBx-siRNA組并無明顯變化。 5.肝損傷的檢測 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA進行高壓注射治療不會影響小鼠血清中ALT和AST轉氨酶的水平；HE染色結果顯示肝臟組織結構正常,無壞死灶,說明HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治療雖然激活天然免疫應答但并不引起明顯肝損傷。 結論及意義： 1、首次設計出兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的3p-HBx-siRNA,并應用于抗HBV的治療,發(fā)現(xiàn)這種雙功能的siRNA較化學合成的siRNA具有更好的HBV抑制和病毒清除效果。 2、3p-HBx-siRNA在通過活化RIG-Ⅰ信號通路誘導干擾素和抗病毒蛋白的產生,還能誘導TNF-αα等抗炎因子的表達,抑制TGF-β、IL-10等免疫抑制性因子的產生從而有效逆轉HBV所致的免疫耐受。 3、化學合成的HBx-siRNA可通過活化PKR信號通路激活肝細胞天然免疫應答,誘導干擾素和抗炎因子的產生,更加有利于siRNA對HBV的抑制和清除。 這種兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的雙功能siRNA具有在降低HBV負荷的同時提高肝臟微環(huán)境中天然和獲得性免疫應答能力,并進而糾正HBV導致的免疫耐受的獨特優(yōu)勢,將為HBV慢性感染,尤其是乙肝免疫耐受,提供新的治療策略和思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【共引文獻】

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本文編號：1468701