本文關(guān)鍵詞： HBV RNA干擾 固有免疫 RIG-I PKR　出處：《山東大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的： RNA干擾(RNAi)是植物和低等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮防御內(nèi)源性核酸的比較保守的機(jī)制。內(nèi)源性的RNAi通路主要通過(guò)siRNA和miRNA兩個(gè)途徑發(fā)揮作用,而miRNA主要是基因組中非完全匹配的非編碼RNA。 目前,RNAi已被廣泛應(yīng)用于抗HBV研究中,并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能夠明顯抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)某些siRNA具有免疫激活作用,能被胞內(nèi)固有免疫受體所識(shí)別。機(jī)體天然免疫系統(tǒng)主要通過(guò)TLRs、PKR、RIG-I等介導(dǎo)對(duì)siRNA的識(shí)別,進(jìn)而活化NF-κB、MAPK、IRF-7等信號(hào)通路,誘導(dǎo)干擾素和炎性因子的產(chǎn)生。 X基因(HBx)是多功能HBV序列的代表,其編碼的X蛋白是所有轉(zhuǎn)錄本均具有的保守序列,因此,是進(jìn)行基因治療的理想靶標(biāo)。在HBV所引起的慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中,既有病毒的始動(dòng)作用,又有機(jī)體固有免疫和獲得性免疫的功能不足,肝臟中HBV的持續(xù)存在可抑制TLRs、RIG-I等介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答,此亦成為HBV持續(xù)性感染進(jìn)一步加重肝臟免疫耐受、影響HBV臨床治療效果的原因之一。因此,對(duì)慢性乙肝的治療要求兼顧抑制病毒和增強(qiáng)免疫功能。降低HBV負(fù)荷的同時(shí)提高肝臟微環(huán)境中天然和獲得性免疫應(yīng)答能力可能會(huì)糾正或逆轉(zhuǎn)HBV導(dǎo)致的免疫耐受。 本研究的目的是通過(guò)設(shè)計(jì)靶向HBx基因的5'-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA)和化學(xué)合成siRNA(HBx-siRNA),觀察該siRNA能否既發(fā)揮特異性的靶基因沉默作用,又能夠激活天然免疫相關(guān)信號(hào)通路,從而改善HBV導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)。 研究方法： 首先,我們以攜帶HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞為模型,觀察轉(zhuǎn)染3p-siRNA對(duì)HBV表達(dá)和復(fù)制的影響及免疫刺激作用。用RT-qPCR的方法檢測(cè)了HBx基因和HBs/p基因的表達(dá)；用ELISA的方法檢測(cè)了HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的含量變化。在免疫刺激作用方面,用RT-qPCR的方法檢測(cè)了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表達(dá)水平；通過(guò)Western blotting檢測(cè)p42/p44 MAPK信號(hào)通路的活化,以及NF-κB信號(hào)通路中IKB的蛋白降解水平；應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察3p-HBx-siRNA對(duì)IFN-β的啟動(dòng)子序列的調(diào)控。另外,我們比較了HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子的差別,發(fā)現(xiàn)感染HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中,RIG-Ⅰ和干擾素相關(guān)基因表達(dá)相對(duì)較低；HepG2細(xì)胞對(duì)poly I：C刺激的免疫應(yīng)答效應(yīng)更為明顯,而HepG2.2.15的反應(yīng)相對(duì)比較遲鈍。這表明,相對(duì)于無(wú)HBV感染的HepG2細(xì)胞,HepG2.2.15細(xì)胞處于免疫抑制狀態(tài)。而3p-HBx-siRNA對(duì)RIG-Ⅰ信號(hào)通路的活化能夠有效逆轉(zhuǎn)這種免疫耐受狀態(tài)。通過(guò)RIG-Ⅰ的過(guò)表達(dá)以及沉默實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步證實(shí),3p-HBx-siRNA能夠通過(guò)活化RIG-Ⅰ信號(hào)通路進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用。 其次,我們將化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞中,進(jìn)一步驗(yàn)證了靶向HBx基因的HBx-siRNA對(duì)HBV的抑制作用,用RT-qPCR的方法檢測(cè)HBx基因以及HBV s/p基因的表達(dá)；用ELISA的方法檢測(cè)了HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的含量變化；通過(guò)Western Blotting技術(shù)觀察了HBx-siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中PKR信號(hào)通路的活化作用,用RT-qPCR的方法檢測(cè)了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表達(dá)水平；通過(guò)PKR的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)和抑制實(shí)驗(yàn),觀察了胞內(nèi)干擾素相關(guān)基因的變化,并檢測(cè)了對(duì)HBV復(fù)制的影響。 最后,我們通過(guò)尾靜脈高壓注射HBV質(zhì)粒的方式建立小鼠HBV感染模型。一方面,通過(guò)灌流法分離小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)染HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA,觀察其對(duì)HBV的抑制作用和免疫激活作用。另一方面,在HBV感染小鼠體內(nèi)進(jìn)行HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的治療,觀察其在小鼠體內(nèi)的免疫激活作用和HBV抑制作用。用放射免疫方法比較了血清中HBsAg和HBeAg的含量變化；用免疫組化的方法檢測(cè)了胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)了小鼠血清中IFN-α、IFN-β,以及免疫抑制因子TGF-β和IL-10的含量；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同淋巴細(xì)胞亞群CD69和NKG2D的表達(dá)。 結(jié)果一體外試驗(yàn)證實(shí)5'-triphosphate-siRNA能夠逆轉(zhuǎn)HBV免疫耐受 1.5'-triphosphate-siRNA的體外轉(zhuǎn)錄以及鑒定 利用T7 RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄方法,我們成功獲得了靶向HBx基因的5'-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA),其序列和化學(xué)合成的siRNA相同,見表1和表2。我們還設(shè)計(jì)了靶向GAPDH以及無(wú)關(guān)序列的3p-siRNA,即3p-GAPDH-siRNA和3p-scramble-siRNA。 2.非特異性3p-siRNA能夠序列非依賴性引起免疫激活作用 將靶向GAPDH和scramble的3p-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.1.15細(xì)胞,檢測(cè)干擾素相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其能激活RIG-Ⅰ通路并誘導(dǎo)干擾素等細(xì)胞因子的表達(dá),并在一定程度上抑制HBV的復(fù)制。 3.化學(xué)合成的siRNA的抗HBV和免疫激活效應(yīng) 化學(xué)合成的HBx-siRNA能夠顯著抑制HBV的復(fù)制,但其對(duì)Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)能力比較弱,誘導(dǎo)倍數(shù)在4-6倍左右。 4.3p-HBx-siRNA的‘'off-target"免疫刺激效應(yīng) 靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA能夠被胞內(nèi)RIG-Ⅰ所識(shí)別,進(jìn)而活化下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和促炎癥因子的表達(dá),并下調(diào)免疫抑制因子IL-]0和TGF-β的表達(dá)。 5.雙功能3p-HBx-siRNA優(yōu)于單純具基因沉默作用的HBx-siRNA 兼具免疫激活作用和直接HBx沉默作用的3p-HBx-siRNA能夠更加有效地抑制HBx、HBV s/p基因的表達(dá),以及上清中HBsAg和HBeAg的分泌,其抑制HBV的效果要明顯優(yōu)于化學(xué)合成HBx-siRNA。 6.3p-HBx-siRNA逆轉(zhuǎn)HBV免疫耐受 攜帶HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞本身處于免疫耐受的狀態(tài),且對(duì)于polyI:C誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)亦不如HepG2細(xì)胞敏感。靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA不僅能夠抑制HBV的復(fù)制,還能夠激活RIG-Ⅰ免疫信號(hào)通路,進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的免疫 耐受。 7.3p-HBx-siRNA的免疫刺激作用和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素有關(guān) 過(guò)表達(dá)RIG-Ⅰ后,3p-HBx-siRNAs的HBV抑制作用更為顯著,并且能夠增強(qiáng)免疫激活作用；RIG-Ⅰ的沉默后,3p-HBx-siRNAs對(duì)HBV的抑制作用明顯削弱。這些結(jié)果進(jìn)一步表明,RIG-Ⅰ信號(hào)通路活化與HBV抑制有關(guān)。而用IFNR1中和抗體將干擾素信號(hào)通路阻斷后,3p-HBx-siRNAs對(duì)HBx基因的抑制作用明顯削減。 結(jié)果二化學(xué)合成的HBx-siRNA能夠通過(guò)激活PKR信號(hào)通路進(jìn)一步抑制HBV的復(fù)制 1. HBx-siRNAs抑制HBV的表達(dá) 化學(xué)合成的HBx-siRNAs不僅能夠沉默HepG2.2.15細(xì)胞HBx基因的表達(dá),還能抑制HBcAg的表達(dá),降低HBsAg和HBeAg的水平,并且這種抑制HBV的效果具有siRNA濃度依賴關(guān)系。 2. HBx-siRNAs誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng) 在HepG2.2.15細(xì)胞中,化學(xué)合成HBx-siRNA可以誘導(dǎo)干擾素效應(yīng),并且其誘導(dǎo)效果隨siRNA轉(zhuǎn)染濃度的升高而增強(qiáng)；HBx-siRNA在誘導(dǎo)干擾素效應(yīng)的同時(shí),還能引起炎癥因子的分泌；其對(duì)趨化因子CXCL2、CCL4、CXCL10的表達(dá)并沒(méi)有顯著影響。 3. HBx-siRNAs能夠誘導(dǎo)PKR以及下游信號(hào)通路的活化 在HepG2.2.15細(xì)胞中,化學(xué)合成HBx-siRNA可以誘導(dǎo)PKR表達(dá)；Western Blotting結(jié)果顯示,胞內(nèi)PKR的磷酸化程度增強(qiáng),并且能明顯促進(jìn)PKR底物eIF-2a的磷酸化；這些結(jié)果顯示,PKR可能介導(dǎo)了HBx-siRNA所誘導(dǎo)的免疫激活作用。 4.PKR介導(dǎo)HBx-siRNAs誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答 和轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組相比,HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBx-siRNAs后,過(guò)表達(dá)PKR可進(jìn)一步促進(jìn)IFN-αα和IFN-p mRNA水平的升高。而用2-AP抑制PKR活性后,干擾素和抗病毒基因的表達(dá)受到明顯影響。結(jié)果提示,PKR的確參與了HBx-siRNAs引起的天然免疫應(yīng)答。 5.進(jìn)一步確認(rèn)PKR活化對(duì)于HBV的抑制作用 我們將PKR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,進(jìn)而分析HBV表達(dá)的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBx和HBs/p表達(dá)水平降低,表現(xiàn)出更加顯著的抗HBV效果。而用2-AP抑制PKR后,HBx-siRNA對(duì)HBV的抑制效果明顯削減。這些結(jié)果說(shuō)明,PKR的活化能夠有效抑制HBV的復(fù)制。 結(jié)果三HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA逆轉(zhuǎn)HBV免疫耐受的體內(nèi)效應(yīng) 1.HBV持留續(xù)存(免疫耐受)小鼠模型的建立 通過(guò)尾靜脈高壓注射的方式成功建立了HBV慢性感染模型,HBV感染比例大約為80%左右。 2.3p-HBx-siRNA對(duì)HBV免疫耐受小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的抗病毒效應(yīng) 膠原酶灌流法提取分離HBV慢性感染小鼠體內(nèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能抑制HBV基因的表達(dá),從而抑制HBV的復(fù)制；均能明顯上調(diào)RIG-Ⅰ的表達(dá)和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。 3.雙功能3p-HBx-siRNA對(duì)HBV免疫耐受小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的HBV抑制效應(yīng) HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA轉(zhuǎn)染小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可明顯抑制HBx和HBsAg的基因表達(dá),降低血清中HBsAg和HBeAg的水平,抑制胞內(nèi)HBcAg的表達(dá),而以3p-HBx-siRNA的作用更明顯。 4. HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA在HBV免疫耐受小鼠體內(nèi)的免疫激活效應(yīng) HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能明顯誘導(dǎo)HBV免疫耐受小鼠IFN-α和IFN-β的分泌,降低血清中TGF-β和IL-10的含量。HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治療對(duì)小鼠肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞的比例并沒(méi)有顯著影響；3p-HBx-siRNA治療可明顯增強(qiáng)肝臟T細(xì)胞、NKT細(xì)胞CD69的表達(dá)；HBx-siRNA能明顯上調(diào)肝臟T細(xì)胞和脾臟NK細(xì)胞CD69的表達(dá)；3p-HBx-siRNA治療可略提高肝臟NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá),而HBx-siRNA組并無(wú)明顯變化。 5.肝損傷的檢測(cè) HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA進(jìn)行高壓注射治療不會(huì)影響小鼠血清中ALT和AST轉(zhuǎn)氨酶的水平；HE染色結(jié)果顯示肝臟組織結(jié)構(gòu)正常,無(wú)壞死灶,說(shuō)明HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治療雖然激活天然免疫應(yīng)答但并不引起明顯肝損傷。 結(jié)論及意義： 1、首次設(shè)計(jì)出兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的3p-HBx-siRNA,并應(yīng)用于抗HBV的治療,發(fā)現(xiàn)這種雙功能的siRNA較化學(xué)合成的siRNA具有更好的HBV抑制和病毒清除效果。 2、3p-HBx-siRNA在通過(guò)活化RIG-Ⅰ信號(hào)通路誘導(dǎo)干擾素和抗病毒蛋白的產(chǎn)生,還能誘導(dǎo)TNF-αα等抗炎因子的表達(dá),抑制TGF-β、IL-10等免疫抑制性因子的產(chǎn)生從而有效逆轉(zhuǎn)HBV所致的免疫耐受。 3、化學(xué)合成的HBx-siRNA可通過(guò)活化PKR信號(hào)通路激活肝細(xì)胞天然免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)干擾素和抗炎因子的產(chǎn)生,更加有利于siRNA對(duì)HBV的抑制和清除。 這種兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的雙功能siRNA具有在降低HBV負(fù)荷的同時(shí)提高肝臟微環(huán)境中天然和獲得性免疫應(yīng)答能力,并進(jìn)而糾正HBV導(dǎo)致的免疫耐受的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),將為HBV慢性感染,尤其是乙肝免疫耐受,提供新的治療策略和思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1468701