本文關(guān)鍵詞： 硫化氫 血管新生 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 microRNAs 生物信息學(xué) 靶基因缺氧誘導(dǎo)因子-1α　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：硫化氫(Hydrogen Sulfide,H2S)是一種無色、有臭雞蛋氣味的氣體,大量吸入可致中毒。然而近年來,研究發(fā)現(xiàn)多種哺乳動物體內(nèi)均能產(chǎn)生H2S。在大鼠和人的血漿中H2S含量約為25-65和25-80μmol/L。體內(nèi)的H2S主要通過胱硫醚-p-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)酶解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CBS和CSE在哺乳動物組織細胞中廣泛存在,前者主要存在于腦和神經(jīng)系統(tǒng),后者主要分布于心血管系統(tǒng)中。據(jù)文獻報道,H2S在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等都具有重要的生理功能。由于能夠內(nèi)源性產(chǎn)生,并具有多種生理功能,H2S已成為繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三個氣體信號分子。 血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上長出新的毛細血管。其過程包括血管外基質(zhì)降解,血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移形成子代血管支和子代血管支獲得血運功能。血管新生可發(fā)生于組織生長發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤生長等多種生理、病理過程中。 MicroRNAs是一類內(nèi)源性的、保守的、由大約22nt(nucleotide)組成的非編碼RNA,它們通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3'-untranslated regions,3'-UTR)完全或不完全互補配對,降解靶mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯。據(jù)估計在哺乳動物體內(nèi),約30%的基因表達受到microRNAs的調(diào)控。microRNAs幾乎參與了各種生物學(xué)過程,其中也包括血管新生。 我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),H2S促進恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞株RF/6A體外血管新生；H2S能促進C57小鼠Matrigel plug模型及雞胚絨毛膜尿囊模型中的血管新生；在大鼠單側(cè)后肢缺血模型中,H2S顯著促進血管新生,并有效改善缺血區(qū)的血供�？梢钥闯�,H2S對血管新生有一定的調(diào)控作用,但具體機制仍有待進一步深入地探尋。目前有關(guān)microRNAs與H2S生物學(xué)功能的聯(lián)系尚未見報道。本課題以microRNAs為切入點,觀察H2S是否能引起體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞microRNAs變化,該變化又是否參與了H2S調(diào)控血管新生的過程。 首先,我們觀察了H2S對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)體外血管新生的作用�？紤]到先前關(guān)于H2S促進體外血管新生的效應(yīng)是在內(nèi)皮細胞株RF/6A中觀察到的,后者與原代內(nèi)皮細胞有一定差異,因此本課題的實驗對象為原代培養(yǎng)的HUVECs。使用NaHS水溶液作為H2S的供體。分別使用BrdU摻入法、劃痕損傷模型和管腔形成實驗觀察H2S對HUVECs增殖、遷移和形成管腔能力的影響。結(jié)果顯示,NaHS(10μmol/L)促進細胞增殖,NaHS(30-200μmol/L)促進細胞遷移并能提高HUVECs在體外形成管腔的能力。通過以上實驗,進一步證實了H2S促進內(nèi)皮細胞血管新生的作用。 接下來,我們利用microRNAs芯片技術(shù),觀察H2S引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞microRNAs的變化。NaHS (50μmol/L)給藥12h組有12個microRNAs表達水平發(fā)生變化,其中6個microRNAs (miR-923、miR-154*、miR-483-5p、miR-195*、miR-640和miR-451)表達降低,6個microRNAs(miR-421、miR-604、miR-192、 miR-29b-1*、miR-455-3p和miR-136*)表達升高。我們結(jié)合文獻報道以及microRNAs靶基因分析,使用實時定量PCR對其中的3個microRNAs(miR-640、 miR-455-3p和miR-192)芯片結(jié)果進行了驗證,結(jié)果一致。 然后,我們進一步對上述3個microRNAs(miR-640.miR-455-3p及miR-192)進行功能分析。通過轉(zhuǎn)染特異的microRNA前體(Pre-MiRNA Precursor molecule)和抑制劑(Anti-MiRNA Inhibitor molecule),分別過表達和阻斷相應(yīng)的microRNA表達,利用劃痕損傷模型和管腔形成實驗對這3個microRNAs進行功能分析。結(jié)果顯示,芯片中表達下調(diào)的miR-640抑制體外血管新生,而表達上調(diào)的miR-455-3p和miR-192均能促進體外血管新生。 最后,我們對這3個microRNAs進行靶基因預(yù)測和鑒定。利用生物信息學(xué)方法從目前常用的數(shù)據(jù)庫中對這3個microRNAs進行靶基因預(yù)測,并運用western blotting實驗進行初步驗證。結(jié)果如下： 1、miR-640 miR-640的基因序列與缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)的編碼基因HIF1A3’UTR有3個結(jié)合位點。過表達miR-640后,HIF-1α蛋白表達減少；抑制miR-640后,HIF-la蛋白表達增多。使用NaHS (50μmol/L)處理HUVECs后,HIF-1α的蛋白表達量升高,受其調(diào)控的VEGF蛋白表達也升高。以上結(jié)果提示HIF1A可能為miR-640的靶基因,miR-640可能是通過調(diào)節(jié)HIF-1α參與了H2S促進血管新生的過程。有待運用熒光素酶報告實驗進一步驗證。 2. miR-192 文獻報道TGF-p誘導(dǎo)miR-192升高,后者降低PTEN表達從而使Akt磷酸化。我們前期實驗觀察到H2S引起HUVECs中TGF-β表達水平升高,提示miR-192水平的升高可能是H2S的直接效應(yīng)或間接由TGF-β介導(dǎo)。過表達miR-192后,PTEN表達減少,Akt磷酸化水平升高；反之亦然。提示miR-192可能通過抑制PTEN,促進Akt磷酸化從而促進血管新生。但是NaHS (50μmol/L)處理HUVECs后,PTEN和Akt磷酸化水平并未改變,提示NaHS (50βmol/L)的促內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成的作用可能不是通過miR-192/PTEN/Akt途徑實現(xiàn)的,miR-192參與H2S促血管新生作用的方式仍需進一步實驗探尋。 3、miR-455-3p 生物信息學(xué)分析提示miR-455-3p的基因序列與FIH(factor inhibitingHIF1)的編碼基因HIF1AN3'UTR有2個結(jié)合位點。有待進一步的實驗鑒定FIH為miR-455-3p的靶蛋白。 綜上所述,本課題的研究發(fā)現(xiàn),H2S能促進HUVECs體外血管新生,并引起microRNAs表達水平發(fā)生變化。miR-640具有抑制HUVECs體外血管新生的作用,miR-192和miR-455-3p具有促進HUVECs體外血管新生的作用。H2S可能通過下調(diào)miR-640,引起miR-640的靶分子HIF-la表達升高,發(fā)揮促進血管新生的作用。通過本課題研究,深入了對H2S促血管新生作用機制的理解,為microRNAs參與氣體分子的生物學(xué)作用提供了新思路；同時觀察到3個microRNAs對血管新生的調(diào)控作用,期待為臨床治療疾病提供新靶點。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：1467203