本文關(guān)鍵詞： 惡性瘧 基因分型 混合株 MSP1 MSP2 GLURP RT-PCR　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：使用體外培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法,了解云南省中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲基因分型的分布特點,以及MSP1各等位基因型的多態(tài)性。在此基礎(chǔ)上,了解惡性瘧混合株在短期培養(yǎng)中蟲株以及優(yōu)勢蟲株的生長變化趨勢。 方法：從現(xiàn)場采集的271份濾紙血樣本或體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲血樣中提取基因組DNA,用巢式PCR (nested-PCR)方法分別擴增惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白質(zhì)1(merozoite surface protein 1, MSP1)和裂殖子表面蛋白質(zhì)2 (merozoite surface protein 2, MSP2)及谷氨酸富有蛋白(glutamate rich protein, GLURP)中具有特異性的片段,進行基因分型研究。在此基礎(chǔ)之上,對鑒定為MSP1基因的36株惡性瘧原蟲進行各等位基因的序列測定,進一步研究云南省中緬邊境惡性瘧原蟲MSP1基因的多態(tài)性。通過對19株惡性瘧混合株短期培養(yǎng),分別提取培養(yǎng)前和后第8天,第14天的基因組DNA,用熒光定量PCR (RT-PCR)方法分別測其的相對表達量,對比培養(yǎng)前后DNA含量的變化,判斷混合感染在實驗室培養(yǎng)條件下,蟲株及優(yōu)勢蟲株的生長變化趨勢。 結(jié)果：1.基因分型(1)MSP1基因分型：單一感染中,271份惡性瘧患者血樣中有87份擴增出MAD20型單一基因片段,78份擴增出K1型單一基因片段,25份擴增出R033型單一基因片段；(2)MSP2基因分型：單一感染中,271份惡性瘧患者血樣中有100份擴增出IC/3D7型基因片段,100份擴增出FC27型基因片段；(3) GLURP的基因分型：271份惡性瘧患者血樣中有262份為單一感染,基因片段在500～1000之間,其中750-850bp大小的分離蟲株出現(xiàn)的頻率最高,屬于優(yōu)勢蟲株。混合感染中,MSP1基因中的MAD20和K1型的混合感染為40份,頻率最高。K1型、MAD20型和R033型的混合感染為9份；MSP2基因的混合感染為57份。在三個等位基因的綜合判斷上,單一株為162份,混合株為109份。而MSP1與MSP2兩種基因同時出現(xiàn)混合感染的樣本只有21份,MSP1、MSP2及GLURP三種基因同時出現(xiàn)混合感染的樣本為1份,表明不同基因型的交叉混合感染率很低。自2007年至2010年,在云南省中緬邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲混合感染率呈逐年上升的趨勢。 2、在基因分型的基礎(chǔ)之上,對鑒定為MSP1基因的36份惡性瘧患者血樣進行序列測定,其中3株為混合株(2株為K1型和R033型混合株,1株為MAD20型和R033型混合株)。經(jīng)DNASTAR軟件分析處理后,10株出現(xiàn)K1型,有三個片段長度大小不同的序列,分別為159bp(2株)、168bp(6株)、195bp(2株)；20株出現(xiàn)MAD20型,有4個片段長度大小不同的序列,分別為159 bp(2株)、168 bp(2株)、186 bp(6株)、195 bp(10株),其中186 bp序列出現(xiàn)四種差異(186-1、2各有2株；186-3、4各有1株),195bp序列出現(xiàn)兩種差異(195-1有9株、195-2有1株)。9株出現(xiàn)R033型,有1個片段長度為159bp的序列,其中序列出現(xiàn)兩種差異。經(jīng)序列對比分析,發(fā)現(xiàn)一個MAD20的新態(tài)型—PF-M6。 3、對惡性瘧混合株的MSP1基因在不同生長時期的動態(tài)研究中,有19個惡性瘧血樣,K1型和MAD20型混合感染的為18個樣本,其中MAD20型在短期培養(yǎng)中DNA含量增多的有13株,K1型有5株；K1、MAD20、RO33型混合感染的只有一個樣本,僅有R033型的DNA含量在培養(yǎng)中增多。 結(jié)論：云南省中緬邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲,在MSP1基因中MAD20型出現(xiàn)的頻率最高,為優(yōu)勢蟲株,K1次之,R033型出現(xiàn)的最少。在MSP2基因中,IC/3D7型和FC27型各占總體的36.9%；GLURP基因以750-850bp大小的分離蟲株出現(xiàn)的頻率最高,為優(yōu)勢蟲株。MSP1基因的混合感染以K1型和MAD20型混合型為主。而MSP1、MSP2、GLURP不同基因的交叉混合感染率則很低。在2007年至2010年各組中,p=0.0770.05,各年份間的MSP1、MSP2和Glurp基因型的總感染情況無顯著性差異,而混合感染率呈逐年上升的趨勢,在拉咱和瓦邦兩地惡性瘧感染的對比中,p=0.0190.05,有地區(qū)性差異。MSP1的序列測定表明中緬邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲具有高度復(fù)雜的遺傳多樣性,而MAD20型在各等位基因型總體分布中是占主要優(yōu)勢的。序列對比分析證實了云南省中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲株的等位基因K1、MAD20、RO33型與泰國、越南、坦桑尼亞等相應(yīng)株/型的序列相一致,在此基礎(chǔ)之上,發(fā)現(xiàn)了一個MAD20的新態(tài)型——PF-M6。惡性瘧原蟲混合株在體外短期培養(yǎng)后,以MAD20型占優(yōu)勢,生長狀態(tài)優(yōu)于其它,其次是K1型,R033型最少,這與以上的基因分型結(jié)果一致,證明MAD20型為優(yōu)勢蟲株。
[Abstract]:Objective : To investigate the distribution characteristics of Plasmodium falciparum gene typing in China - Myanmar border area of Yunnan Province and the polymorphism of MSP1 alleles using in vitro culture and molecular biology method . Methods : Genomic DNA was extracted from 271 filter paper blood samples collected from the site or in vitro cultured Plasmodium falciparum blood samples . The sequence of merozoite surface protein 1 ( MSP1 ) and merozoite surface protein 2 ( MSP2 ) and glutamic acid rich protein ( GLURP ) were amplified by nested - PCR . Results : 1 . genotyped ( 1 ) MSP1 genotyping : In single infection , there were 87 amplified single gene fragments of MAD20 , 78 amplified out of single gene fragment of type K1 , 100 of which amplified the single gene fragment of type K 1 , and ( 2 ) the mixed infection of MSP1 , MSP2 and GLURP was only 21 , and the mixed infection rate of MSP1 , MSP2 and GLURP was 1 part . 2 . On the basis of genotyping , 36 patients with MSP1 gene were sequenced . Three of them were mixed strains ( 2 strains of type K1 and R33 type , 1 strain MAD20 and R33 type ) . There were two different sequences of length and size of three fragments : 159 bp ( 2 strains ) , 168 bp ( 2 strains ) , 186 bp ( 6 strains ) and 195 bp ( 10 strains ) .


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本文編號：1457803