發(fā)布時(shí)間：2018-01-22 17:44

  本文關(guān)鍵詞： 鈉氫交換蛋白-1 重組腺病毒 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)pH值　出處：《遼寧醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 構(gòu)建靶向人NHE-1基因RNAi腺病毒表達(dá)載體,確定其感染SH-SY5Y細(xì)胞最佳MOI值及其對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)pH值的影響。 方法 首先利用PCR檢測(cè)目的基因人NHE-1在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)量,確定HEK-293細(xì)胞為干擾載體轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞;針對(duì)目的基因NHE-1及內(nèi)參基因ACTB(Beta Actin)設(shè)計(jì)、合成熒光定量PCR引物三對(duì),并對(duì)各基因以及各個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化,再依次通過(guò)退火、連接,構(gòu)建含NHE-1前體miRNA的重組干擾質(zhì)粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNATM 6.2-GW/ neg-miR,并轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR的方法評(píng)價(jià)干擾效應(yīng),篩選出干擾效應(yīng)最佳的靶序列;將干擾效應(yīng)最佳片段使用BP重組系統(tǒng)重組到載體pDONR22 1,再使用LR重組系統(tǒng)將目的序列重組到腺病毒載體pAD/CMV/V5-DEST上,經(jīng)測(cè)序獲得腺病毒干擾質(zhì)粒pAd-miR-NHE1,以Pac I酶切線性化后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝含有腺病毒E1的HEK-293細(xì)胞,空斑傳代純化病毒并反復(fù)凍融擴(kuò)增病毒,用免疫法快速檢測(cè)腺病毒滴度;采用不同MOI值進(jìn)行梯度試驗(yàn),確定人NHE-1基因靶向RNAi腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞最佳MOI值。按照最佳MOI值感染SH-SY5Y細(xì)胞,利用熒光指示劑BCECF-AM方法熒光分光光度計(jì)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)pH值變化,Western Blotting(WB)檢測(cè)NHE-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果 PCR檢測(cè)目的基因人NHE-1在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)豐度較高,確定HEK-293細(xì)胞為干擾載體轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞;RT-PCR的方法評(píng)干擾效應(yīng)最佳的靶序列為NHE1-4;對(duì)腺病毒載體骨架及干擾載體骨架進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示腺病毒載體骨架擴(kuò)增片段約300bp,干擾載體骨架擴(kuò)增片段約200bp,與預(yù)期產(chǎn)物大小相符,提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功;按照腺病毒感染性滴度快速測(cè)定試劑盒的方法對(duì)Ad-miR-NHE1腺病毒病毒液的滴度進(jìn)行測(cè)定,得出Ad-miR-NHE1的滴度約4×109;采用不同MOI值進(jìn)行梯度試驗(yàn),確定人NHE-1靶向RNAi腺病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞最佳MOI值為160;按照最佳MOI值將NHE1-miRNA腺病毒感染至SH-SY5Y細(xì)胞,熒光指示劑法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值,RNAi腺病毒感染組細(xì)胞內(nèi)pH值24h為5.969±0.030、48h為5.981±0.023、72h為5.975±0.024,負(fù)對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值24h為6.050±0.043、48h為6.038±0.069、72h為6.026±0.050,空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值24h為6.031±0.061、48h為6.048±0.042、72h為6.031±0.042,24hRNAi腺病毒感染組細(xì)胞內(nèi)pH值較空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組降低,P值分別為0.015及0.002,差別有顯著性意義(P0.05),空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值無(wú)明顯變化,P值為0.399,差異無(wú)顯著性意義(P0.05),48hRNAi腺病毒感染組細(xì)胞內(nèi)pH值較空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組降低,P值分別為0.012及0.030,差別有顯著性意義(P0.05),空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值無(wú)明顯變化,P值為0.683,差異無(wú)顯著性意義(P0.05),72hRNAi腺病毒感染組細(xì)胞內(nèi)pH值較空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組降低,P值分別為0.010及0.018,差別有顯著性意義(P0.05),空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值無(wú)明顯變化,P值為0.805,差異無(wú)顯著性意義(P0.05),感染RNAi腺病毒后24h較48h和72h組細(xì)胞內(nèi)pH值變化無(wú)明顯差別,P值分別為0.703和0.723,差異無(wú)顯著性意義(P0.05),48h較72h組細(xì)胞內(nèi)pH值無(wú)明顯變化,P值為0.463,差異無(wú)顯著性意義(P0.05);感染RNAi腺病毒后24h收集SH-SY5Y細(xì)胞總蛋白, WB檢測(cè)RNAi腺病毒感染組NHE-1蛋白較空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組表達(dá)下降,差別有顯著性意義(P0.05),空白對(duì)照組和負(fù)對(duì)照組NHE-1蛋白差異無(wú)顯著性意義(P0.05),證實(shí)成功沉默NHE-1基因表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值下降。 結(jié)論 成功構(gòu)建最佳靶向人NHE-1基因RNAi腺病毒表達(dá)載體,通過(guò)利用小干擾RNA技術(shù)抑制細(xì)胞表面NHE-1基因表達(dá),建立了細(xì)胞內(nèi)酸化模型,為探索細(xì)胞內(nèi)的酸性變化與β淀粉樣蛋白產(chǎn)生和降解相關(guān)酶類的改變提供了有效的工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:objective
The target human NHE-1 gene RNAi adenovirus expression vector was constructed to determine the optimal MOI value of SH-SY5Y cells and its effect on the pH value in SH-SY5Y cells.
Method
The expression of PCR gene NHE-1 in HEK-293 cells, HEK-293 cells were identified as cells transfected with interference vector model; according to the NHE-1 gene and reference gene ACTB (Beta Actin) design, synthesis of fluorescent quantitative PCR primers three pairs, and each gene and each primer for PCR amplification conditions, followed by annealing, connection, construct containing NHE-1 precursor miRNA recombinant plasmid pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR and negative control plasmid pcDNATM 6.2-GW/ neg-miR was transfected into HEK-293 cells by RT-PCR method to evaluate the interference effect, select the best target sequence interference; interference effect will best use of recombinant fragment BP recombination system to vector pDONR22 1, and then to the sequence of recombinant adenovirus vector to pAD/CMV/V5-DEST using LR recombination system, obtained by sequencing adenovirus plasmid pAd-miR-NHE1 Pac was linearized with I After transfected into packaging containing adenovirus E1 HEK-293 cells, plaque purified virus and repeated freeze-thaw virus amplification, rapid detection of adenovirus titer by immune method; using different MOI values by gradient test, determine the human NHE-1 gene targeting RNAi adenovirus infected SH-SY5Y cells. The best MOI value according to the best MOI value the infection of SH-SY5Y cells, using the fluorescent indicator BCECF-AM fluorescence spectrophotometer to detect the SH-SY5Y intracellular pH changes, Western Blotting (WB) to detect the expression of NHE-1 protein.
Result
Objective to detect the PCR gene NHE-1 expression in HEK-293 cells was higher, the HEK-293 cells were identified as interference vector transfected cells RT-PCR model; evaluation method of target sequence interference effect best is NHE1-4; the detection of PCR adenovirus vector and vector skeleton. The results showed that the adenovirus skeleton fragment about 300bp interference vector backbone fragment is about 200bp, and the size of the expected product line, suggesting the best NHE-1 targeting human RNAi virus expression vector was successfully constructed; titer of adenovirus to Ad-miR-NHE1 solution method according to the kit for quick determination of the titer of adenovirus infection titer determination, that Ad-miR-NHE1 is about 4 * 109; with different MOI value gradient the test, determine the NHE-1 targeting adenovirus RNAi SH-SY5Y cells infected with the optimum MOI value is 160; in accordance with the best MOI value of the NHE1-miRNA adenovirus infection to SH-SY5Y cells. Cell detection light indicator method in pH value, RNAi adenovirus infection group intracellular pH 24h 5.969 + 0.030,48h 5.981 + 0.023,72h 5.975 + 0.024, negative group of intracellular pH 24h 6.050 + 0.043,48h 6.038 + 0.069,72h 6.026 + 0.050 in the control, the blank control group, intracellular pH 6.031 + 24h 0.061,48h 6.048 + 0.042,72h 6.031 + 0.042,24hRNAi adenovirus infection group intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.015 and 0.002, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells had no obvious change of pH value, P value is 0.399, no significant difference (P0.05), adenovirus 48hRNAi infection group, the intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.012 and 0.030, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells pH value had no obvious change, P value 0.6 83, no significant difference (P0.05), adenovirus 72hRNAi infection group, the intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.010 and 0.018, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells pH value had no obvious change, P value 0.805, no significant difference (P0.05), RNAi infection of adenovirus 24h is 48h and 72h group pH values had no significant difference, P values were 0.703 and 0.723, there was no significant difference (P0.05, 48h) compared with 72h group, the intracellular pH had no obvious change, P value 0.463, no significant difference (P0.05); infection of adenovirus RNAi 24h after collecting the total protein of SH-SY5Y cells, WB detection of RNAi adenovirus infection group NHE-1 protein compared with the blank control group and negative control group was decreased, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group NHE-1 protein had no significant difference the meaning of (P0.05), It was confirmed that the successful silencing of the expression of NHE-1 gene resulted in the decrease of pH in the cells.
conclusion
The best expression vector targeting human NHE-1 gene RNAi adenovirus was successfully constructed, inhibition of cell surface expression of NHE-1 gene by using small interfering RNA technology, established a model for exploring the intracellular acidification, intracellular acid changes and amyloid formation and degradation enzymes change provides the basis for effective work.

【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

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8 馬s，

本文編號(hào)：1455330