本文關鍵詞： 細粒棘球絳蟲 排泄分泌抗原 樹突狀細胞 免疫調節(jié) 雙向電泳 質譜分析 免疫印跡 克隆 重組表達 生物信息學分析　出處：《中國疾病預防控制中心》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：包蟲病是一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病,我國是包蟲病發(fā)病最高的國家之一,其預防控制面臨嚴峻挑戰(zhàn)。在我國主要以細粒棘球絳蟲感染引起的囊性包蟲病為主。包蟲病疫苗是理想的疾病控制手段,但仍未取得突破,制約包蟲病疫苗研究的一大瓶頸是包蟲病感染引起的免疫應答及其調節(jié)機制尚未明確。細粒棘球絳蟲的生活史較為復雜,涉及人、牛、羊等中間宿主和犬等終末宿主,成蟲寄生在終末宿主的小腸內,蟲體成熟后,蟲卵隨著糞便排出體外。中間宿主主要通過接觸終末宿主糞便,或誤食蟲卵感染的水、蔬菜、瓜果等而發(fā)生感染。值得一提的是,犬作為終末宿主是包蟲病的主要傳染源,預防控制犬被認為是阻斷包蟲病傳播的理想途徑,并且對犬實行免疫也更經濟、有效。排泄分泌抗原直接與宿主相互作用,能調節(jié)宿主免疫應答,在細粒棘球絳蟲感染的免疫逃避中發(fā)揮重要作用。研究感染過程中細粒棘球絳蟲通過排泄分泌抗原調節(jié)宿主免疫應答關鍵分子及其作用機制,對于阻斷包蟲病傳播的犬用疫苗的研究有作用意義,為包蟲病疫苗的設計和優(yōu)化提供重要的分子基礎和新思路。 第一部分 細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原免疫學功能研究 排泄分泌抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng),是調節(jié)宿主免疫應答的主要成分。樹突狀細胞(dentridic cell, DC)是目前所知功能最強、也是唯一能夠激活初始性T細胞(native Tcell)的專職抗原提呈細胞,控制著體內免疫反應的過程,是寄生蟲調控宿主免疫應答的重要靶點之一。故通過樹突狀細胞對細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原的免疫學功能和作用機制進行初步的探討。 用重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)誘導小鼠骨髓細胞,獲取小鼠髓源樹突狀細胞(BMDC)。用細粒棘球絳蟲成蟲蟲體抗原和排泄分泌抗原分別刺激體外培養(yǎng)的BMDC,檢測其DC表型和細胞因子分泌的變化以探索不同抗原活化DC的能力。將抗原刺激過得DC與T細胞共培養(yǎng),檢測T細胞表型及細胞因子分泌的變化以探索不同抗原對DC活化T細胞的能力的影響,探討排泄分泌抗原免疫調節(jié)作用。 結果,細粒棘球絳蟲成蟲排泄分泌抗原抑制DC的活化,表現為抑制MHC-Ⅱ、 CD86/CD80的表達及抑制IL-12等細胞因子的分泌；而蟲體抗原能誘導DC經典活化,增強DC共刺激分子MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表達和IL-6、IL-12p40等細胞因子的分泌。排泄分泌抗原刺激的DC與小鼠T細胞共培養(yǎng),T細胞產生的細胞因子與對照組(PBS組)相比無顯著變化,并發(fā)現排泄分泌抗原能誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg產生；而蟲體抗原刺激后所產生的IFN-y水平大大增加,IL-4水平明顯降低。DC攝取雞卵白蛋白(OVA)后用CpG刺激,排泄分泌抗原可下調由CpG誘導的DC活化,顯示出強大的抑制能力。 結果表明,細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原能通過抑制DC成熟、抑制DC活化T細胞、抑制CpG誘導的DC活化,誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的產生來下調宿主免疫應答。 第二部分 細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原蛋白質組學分析 通過蛋白質組學技術對細粒棘球絳蟲成蟲階段的蟲體蛋白和排泄分泌蛋白進行蛋白表達譜和抗原蛋白表達譜分析,為深入研究其中有價值的蛋白分子,闡明寄生蟲-宿主相互作用機制,并尋找有效的疫苗候選分子、診斷分子及藥物作用靶標奠定基礎。 將細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原和蟲體按雙向電泳要求制備蛋白樣品,上樣進行等電聚焦電泳和SDS-PAGE,凝膠用考馬斯亮藍染色后掃描。蛋白斑點經酶解后進行MALDI-TOF MS分析。未染色的凝膠將蛋白電轉至PVDF膜上,用細粒棘球絳蟲感染犬血清進行免疫印跡分析,DAB顯色。質譜分析得到的肽指紋圖譜在數據庫搜索匹配以鑒定蛋白。 結果,經雙向電泳分離,細粒棘球絳蟲成蟲排泄分泌蛋白中分離出約50個蛋白斑點,主要集中在分子量20～100kDa,等電點4-9之間的區(qū)域,挑選出其中48個豐度較高的蛋白斑點進行質譜分析。細粒棘球絳蟲成蟲蟲體蛋白中共分離出約200個蛋白斑點,這些蛋白斑點大部分分布在等電點4.5-9之間的區(qū)域,挑選出其中192個豐度較高的蛋白斑點進行質譜分析。用細粒棘球絳蟲感染犬血清對蟲體蛋白進行免疫印跡分析,得到36個具有抗原性的蛋白斑點。經MALDI-TOF MS質譜分析,鑒定出一系列與寄生蟲生長、發(fā)育、運動、調控相關的蛋白。細粒棘球絳蟲排泄分泌蛋白鑒定出34個蛋白斑點,9個蛋白；成蟲蟲體蛋白鑒定出61個蛋白斑點,32個蛋白；抗原性蛋白中鑒定出21個蛋白斑點,13個蛋白,其中7個為首次發(fā)現。經生物信息學功能分析,這些蛋白主要是細胞骨架類蛋白,分子伴侶類蛋白以及代謝調控相關蛋白。 第三部分 細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原分子的克隆、表達和分析 在第一部分和第二部分研究結果的基礎上,從5個同時存在于細粒棘球絳蟲成蟲蟲體蛋白和排泄分泌蛋白的抗原性蛋白分子中挑選出烯醇酶(Enolase)和親環(huán)蛋白(Cyclophilin)進行克隆、重組表達和生物信息學分析,為進一步研究該蛋白的作用機制奠定基礎。 抽取細粒棘球絳蟲成蟲總RNA,逆轉錄制備cDNA。以cDNA為模板,擴增出細粒棘球絳蟲烯醇酶(EgEno)和親環(huán)蛋白(EgCyp)基因,克隆入表達載體pET28a,構建重組表達質粒,轉化大腸桿菌BL21(DE3),經異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達后,進行SDS-PAGE和Western blotting鑒定,并對其進行生物信息學分析。 結果表明,成功克隆出EgEno和EgCyp基因,EgEno基因ORF序列為1302bp,編碼433個氨基酸,EgCyp基因ORF序列為489bp,編碼162個氨基酸。成功構建了重組表達系統(tǒng),經SDS-PAGE分析,重組蛋白在E. coli BL21(DE3)中獲得高效表達,其中重組EgEno蛋白分子量約為50kDa,重組EgCyp蛋白分子量約為22kDa。用所里棘球絳蟲感染犬血清進行western blotting,兩個重組蛋白均可被識別,顯示出良好的抗原性。生物信息學分析顯示EgEno有16個潛在抗原表位,EgCyp有7個潛在抗原表位,提示EgEno和EgCyp具有潛在免疫診斷或免疫預防等應用價值。 結論 1.細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原能通過抑制DC成熟,抑制DC活化T細胞來下調宿主免疫應答,其抑制作用可能是通過誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞而發(fā)揮。 2.獲得了細粒棘球絳蟲成蟲蟲體排泄分泌抗原的蛋白表達譜及蟲體的抗原性蛋白譜,并鑒定出一系列與寄生蟲生長、發(fā)育、運動、調控相關的蛋白。 3.成功克隆了兩個排泄分泌抗原分子,烯醇酶和親環(huán)蛋白基因,并在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中成功重組表達,重組蛋白顯示了良好的抗原性,具有潛在免疫診斷或免疫預防等應用價值。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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