本文關(guān)鍵詞： 血管平滑肌細(xì)胞 自噬 增殖 雷帕霉素 3-MA 凝血酶　出處：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:探討自噬作用與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖之間的關(guān)系。為防治VSMC異常增殖提供新的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法:用健康SD大鼠的腹主動(dòng)脈進(jìn)行VSMC的原代培養(yǎng),培養(yǎng)基選用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM,培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。培養(yǎng)3～5天有細(xì)胞爬出,7～9天左右可進(jìn)行第一次傳代。根據(jù)檢測方法的不同可分為:①用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測的細(xì)胞接種于放有小圓玻片的24孔板內(nèi),細(xì)胞按5×104個(gè)/ml細(xì)胞密度,每孔1ml。②用于免疫印跡檢測的細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞按5×105個(gè)/ml細(xì)胞密度,每瓶3ml。實(shí)驗(yàn)選用3～6代VSMC,VSMC傳代后靜置培養(yǎng)16 h,等細(xì)胞完全貼壁后換用含0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h進(jìn)行同步化處理(使所有細(xì)胞處于細(xì)胞周期的靜止期),隨后分為七個(gè)組:①對照組;②雷帕霉素(RPM)組(10 ng/ml);③3-甲基腺嘌呤(3-MA)組(10 ng/ml);④凝血酶(F2)組(1 U/ml);⑤雷帕霉素(10 ng/ml)+凝血酶組(1 U/ml);⑥3-MA(10 ng/ml)+凝血酶組(1U/ml);⑦雷帕霉素(10 ng/ml)+胃酶抑素(Pep)組(0.01μmol/ml)。不同藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,通過免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡方法檢測各組VSMC的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達(dá)變化。 結(jié)果: 一.自噬對VSMC增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分別用雷帕霉素和3-MA作用VSMC,用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot方法檢測PCNA、LC3表達(dá)變化,結(jié)果表明:雷帕霉素作用VSMC后與對照組相比能明顯抑制其增殖(P0.01),而3-MA則促進(jìn)VSMC增殖(P0.01)。Western Blot檢測PCNA蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步表明F2能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖,但與雷帕霉素共同作用時(shí),F2的促平滑肌增殖作用大大降低(P0.01),3-MA與F2共作用時(shí)有促VSMC增殖作用。 二.增殖因素(F2)對VSMC自噬與增殖的影響 凝血酶(F2)是促VSMC增殖劑,在VSMC中加入F2后LC3表達(dá)有所降低,PCNA的表達(dá)明顯上調(diào);F2與雷帕霉素共同作用時(shí),LC3的表達(dá)明顯上升,而PCNA則顯著下調(diào);但與單獨(dú)使用雷帕霉素組相比LC3的表達(dá)量又有一定降低,F2與3-MA同時(shí)作用時(shí),自噬被抑制,而PCNA明顯上調(diào),與單獨(dú)使用3-MA的組相比LC3的表達(dá)量也有一定降低。 三.自噬抑VSMC增殖的機(jī)制研究 實(shí)驗(yàn)選用胃酶抑素抑制溶酶體途徑,檢測LC3、PCNA的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃酶抑素與雷帕霉素共同作用時(shí),LC3表達(dá)上調(diào),而PCNA的表達(dá)與雷帕霉素組相比明顯上調(diào),與3-MA組相比PCNA表達(dá)更顯著。 結(jié)論: 1、雷帕霉素的抑VSMC作用與自噬激活有關(guān),自噬作用能抑制VSMC增殖。 2、促進(jìn)細(xì)胞增殖因素(F2)有降低自噬水平的作用,但效果不顯著。 3、自噬抑VSMC的作用機(jī)理與溶酶體途徑有關(guān)。
[Abstract]:Aim: to investigate the relationship between autophagy and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs), and to provide a new theoretical basis for the prevention and treatment of abnormal proliferation of VSMC. Methods: the abdominal aorta of healthy SD rats was cultured in primary culture medium containing 10% fetal bovine serum. The culture condition was 5 CO 2. At 37 鈩，

本文編號：1453955