本文關鍵詞： 血管平滑肌細胞 自噬 增殖 雷帕霉素 3-MA 凝血酶　出處：《蘇州大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:探討自噬作用與血管平滑肌細胞(VSMC)增殖之間的關系。為防治VSMC異常增殖提供新的理論依據(jù)。 實驗方法:用健康SD大鼠的腹主動脈進行VSMC的原代培養(yǎng),培養(yǎng)基選用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM,培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。培養(yǎng)3～5天有細胞爬出,7～9天左右可進行第一次傳代。根據(jù)檢測方法的不同可分為:①用于免疫細胞化學檢測的細胞接種于放有小圓玻片的24孔板內(nèi),細胞按5×104個/ml細胞密度,每孔1ml。②用于免疫印跡檢測的細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中,細胞按5×105個/ml細胞密度,每瓶3ml。實驗選用3～6代VSMC,VSMC傳代后靜置培養(yǎng)16 h,等細胞完全貼壁后換用含0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h進行同步化處理(使所有細胞處于細胞周期的靜止期),隨后分為七個組:①對照組;②雷帕霉素(RPM)組(10 ng/ml);③3-甲基腺嘌呤(3-MA)組(10 ng/ml);④凝血酶(F2)組(1 U/ml);⑤雷帕霉素(10 ng/ml)+凝血酶組(1 U/ml);⑥3-MA(10 ng/ml)+凝血酶組(1U/ml);⑦雷帕霉素(10 ng/ml)+胃酶抑素(Pep)組(0.01μmol/ml)。不同藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,通過免疫細胞化學、免疫印跡方法檢測各組VSMC的增殖細胞核抗原(PCNA)和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的表達變化。 結果: 一.自噬對VSMC增殖的影響 實驗分別用雷帕霉素和3-MA作用VSMC,用免疫細胞化學和Western Blot方法檢測PCNA、LC3表達變化,結果表明:雷帕霉素作用VSMC后與對照組相比能明顯抑制其增殖(P0.01),而3-MA則促進VSMC增殖(P0.01)。Western Blot檢測PCNA蛋白表達結果進一步表明F2能促進平滑肌細胞的增殖,但與雷帕霉素共同作用時,F2的促平滑肌增殖作用大大降低(P0.01),3-MA與F2共作用時有促VSMC增殖作用。 二.增殖因素(F2)對VSMC自噬與增殖的影響 凝血酶(F2)是促VSMC增殖劑,在VSMC中加入F2后LC3表達有所降低,PCNA的表達明顯上調(diào);F2與雷帕霉素共同作用時,LC3的表達明顯上升,而PCNA則顯著下調(diào);但與單獨使用雷帕霉素組相比LC3的表達量又有一定降低,F2與3-MA同時作用時,自噬被抑制,而PCNA明顯上調(diào),與單獨使用3-MA的組相比LC3的表達量也有一定降低。 三.自噬抑VSMC增殖的機制研究 實驗選用胃酶抑素抑制溶酶體途徑,檢測LC3、PCNA的表達變化,結果發(fā)現(xiàn),胃酶抑素與雷帕霉素共同作用時,LC3表達上調(diào),而PCNA的表達與雷帕霉素組相比明顯上調(diào),與3-MA組相比PCNA表達更顯著。 結論: 1、雷帕霉素的抑VSMC作用與自噬激活有關,自噬作用能抑制VSMC增殖。 2、促進細胞增殖因素(F2)有降低自噬水平的作用,但效果不顯著。 3、自噬抑VSMC的作用機理與溶酶體途徑有關。
[Abstract]:Aim: to investigate the relationship between autophagy and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs), and to provide a new theoretical basis for the prevention and treatment of abnormal proliferation of VSMC. Methods: the abdominal aorta of healthy SD rats was cultured in primary culture medium containing 10% fetal bovine serum. The culture condition was 5 CO 2. At 37 鈩，

本文編號：1453955