本文關鍵詞： 樹突狀細胞 骨橋蛋白 乙型肝炎病毒 HBcAg HBsAg　出處：《浙江大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景及目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染目前仍是嚴重影響中國乃至世界人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。但目前發(fā)病機制不明。 病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程中均與免疫細胞的活化及細胞因子的產(chǎn)生有密切的關系。樹突狀細胞(Dendriticcells,DC)在乙型肝炎病毒的識別及抗原呈遞過程中起重要作用,影響病毒性肝炎病理生理過程中Thl、Th2的活化。研究發(fā)現(xiàn)DC既可誘導對肝炎病毒的免疫,又可誘導免疫耐受,取決于DC的活化狀態(tài)。并有研究發(fā)現(xiàn)在HBV病毒未清除患者中DC的功能受損,并在抗病毒治療后,病毒清除過程中DC的功能得到一定的恢復,同時伴隨著T細胞功能的恢復。 骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)是一種分泌性磷酸化糖蛋白,作為免疫調(diào)節(jié)因子在DC的分化,成熟、存活方面發(fā)揮重要作用。本實驗室之前的研究證明OPN在多種肝臟疾病中大量表達,與肝炎、肝癌、肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展及預后密切相天。 本實驗目的在于揭示在乙肝病毒感染過程中骨橋蛋白對樹突狀細胞的成熟以及分泌功能的影響,進而研究乙型肝炎中骨橋蛋白對樹突狀細胞作用的調(diào)節(jié)作用。 材料及方法 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓細胞進行培養(yǎng),并給與IL-4和GM-CSF誘導向DC方向的分化。于第六天分別給予刺激：LPS, HepG2.2.15培養(yǎng)上清,HepG2培養(yǎng)上清,HBcAg,HBsAg,以及空白對照,共十二組。于48h后收集細胞及培養(yǎng)上清。通過流式細胞儀檢測DC表面CD分子的表達,通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠脾臟單個核細胞,并通過磁珠分選獲得CD4+T細胞,野生鼠來源DC或骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC分別與野生鼠來源或骨橋蛋白基因敲除小鼠來源CD4+T細胞共培養(yǎng),培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清。通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。 收集健康成人抗凝血分離PBMC并進行培養(yǎng),使用骨橋蛋白中和性抗體阻斷骨橋蛋白作用。分別給予刺激LPS,HBcAg, HBsAg,于培養(yǎng)24h后收集細胞和上清。通過流式細胞儀檢測DC表面CD分子的表達,通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。 結果 野生型小鼠來源DC與骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC,在無抗原刺激情況下表面CD80,CD86,MHC-II分子表達無明顯差異,在接受HepG2.2.15培養(yǎng)上清或HBsAg刺激后,骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓來源DC表達CD80,CD86, MHC-II分子明顯下降,其成熟受到抑制。但HBcAg刺激則使骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC的CD80,CD86,MHC-II分子表達有所升高。 通過對DC分泌IFN-a,IL-12的分析,發(fā)現(xiàn)在無抗原刺激時骨橋蛋白缺陷的DC與野生鼠來源DC相比IFN-a分泌水平降低,在HBV抗原刺激后仍低于野生鼠來源的DC的分泌水平,IL-12的表達類似。還發(fā)現(xiàn),雖然在HBcAg抗原刺激后骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC表面CD分子表達升高,但其分泌功能是下降的。 通過對不同來源DC與相同來源CD4+T的共培養(yǎng)并檢測Th1細胞因子以及Th2細胞因子,發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC的共培養(yǎng)與野生鼠來源DC的共培養(yǎng)相比,培養(yǎng)上清中Thl細胞因子TNF-a分泌減少,而Th2細胞因子IL-4,IL-6,IL-10的產(chǎn)生水平升高。 同時通過對相同來源DC與不同來源CD4+T的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來源相同的DC和來源不同的CD4+T共培養(yǎng)對此實驗中產(chǎn)生細胞因子無明顯影響,更進一步證明在DC誘導的T細胞反應過程中DC是否產(chǎn)生骨橋蛋白對細胞因子的產(chǎn)生起決定的作用。 通過人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體封閉骨橋蛋白功能,發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白抗體使DC表面CD80,CD86的水平降低,在HBV抗原刺激后保持同樣的趨勢,說明骨橋蛋白功能被阻斷后,DC的成熟受到抑制。 通過人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體來封閉骨橋蛋白功能,發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白功能被阻斷后可導致DC分泌IL-12功能下降,同時Thl型細胞因子IFN-a分泌降低,而Th2型細胞因子分泌水平升高。 結論 1.DC在發(fā)育和成熟過程中能夠分泌大量骨橋蛋白,并且骨橋蛋白在DC發(fā)育以及成熟過程中發(fā)揮重要作用。 2.骨橋蛋白的缺乏或不足抑制HBV抗原刺激后DC表面CD80,CD86分子的表達,使DC的成熟受抑制。 3.骨橋蛋白的缺乏或不足導致HBV抗原刺激后DC分泌細胞因子水平下降,分泌功能受影響。 4.骨橋蛋白的缺乏或不足導致DC表型和功能的缺陷使DC在HBV抗原刺激后誘導Thl細胞活化這一過程受到抑制,導致Th1/Th2細胞因子的失衡,從而影響DC在乙肝病毒感染過程中發(fā)揮功能。
[Abstract]:Background and purpose of research
Hepatitis B virus (HBV) infection is still an important public health problem that seriously affects human health in China and the world. However, the pathogenesis is unknown.
Viral hepatitis occurred in the process of the development and activation of immune cells and cytokines are closely related. Dendritic cells (Dendriticcells, DC) play an important role in the recognition and antigen presentation of hepatitis B virus in viral hepatitis, influence of pathological physiology process in Thl, the activation of Th2. The study found DC can induce immunity to hepatitis B virus, and can induce immune tolerance and activation depends on the state of DC. And studies have found that damaged in the HBV virus is not clear in patients with DC, and after antiviral therapy, viral clearance during DC function was recovered to a certain extent, with the function of T cells recovery.
Osteopontin (Osteopontin, OPN) is a secreted phosphorylated glycoprotein, as immune regulator in mature DC differentiation, and play an important role in survival. Our previous research proved that high expression of OPN in various liver diseases and hepatitis, liver cancer, liver fibrosis occurrence development and prognosis was closely related to the day.
The purpose of this experiment is to reveal the effect of osteopontin on the maturation and secretion function of dendritic cells in the process of HBV infection, so as to further investigate the regulatory role of osteopontin in dendritic cells in hepatitis B virus infection.
Materials and methods
Take wild mouse gene and osteopontin knockout mice bone marrow cells were cultured in differentiation and give IL-4 and induced by GM-CSF to DC direction. On the sixth day were given stimulus: LPS, supernatant of HepG2.2.15 culture supernatant, HepG2, HBcAg, HBsAg, and blank control, a total of twelve groups. After 48h cells and culture supernatants were collected. Expression using flow cytometry DC surface CD molecules, cytokines levels of culture supernatant was detected by ELISA
Were collected from the wild rats and osteopontin gene knockout mice spleen mononuclear cells and CD4+T cells by immunomagnetic sorting, gene DC or wild mouse osteopontin knockout mice derived respectively with DC gene sources or wild mouse osteopontin knockout mice CD4+T cells were co cultured, 24h culture supernatant was collected. Cultivation of cytokines in the supernatant was detected by ELISA.
Collect healthy adult anticoagulant PBMC isolated and cultured, using osteopontin neutralizing antibody blocking osteopontin. Stimulation of LPS were given HBcAg, HBsAg, and 24h cells were collected and cultured in the supernatant. The expression was detected by flow cytometry DC surface CD molecules, cytokines levels of culture supernatant was detected by ELISA.
Result
Wild type mice from DC and OPN knock-out mice. DC, CD86 in the absence of surface antigen stimulation CD80 cases, the expression of MHC-II had no significant difference in the HepG2.2.15 culture supernatant or after HBsAg stimulation, osteopontin gene knockout mouse bone marrow-derived DC expression of CD80, CD86, MHC-II molecules decreased, the inhibition of mature but the HBcAg. Stimulation of OPN knock-out mice. DC, CD80, CD86, MHC-II expression increased.
By IFN-a on the secretion of DC, IL-12 analysis, found in the absence of antigen stimulation of osteopontin deficient DC and DC from wild type mice compared to IFN-a secretion levels decreased in HBV after antigen stimulation is still lower than the level of DC secretion from wild type mice, the expression of IL-12. Also found that although the osteopontin gene on HBcAg after antigen stimulation mice derived DC surface expression of CD molecules increased, but its secretion was decreased.
According to the different sources of DC and CD4+T were co cultured with the same source and detection of Th1 cytokines and Th2 cytokines, found that osteopontin knockout mice co cultured DC were co cultured with DC from wild type mice compared to the culture supernatant of Thl cytokine TNF-a secretion decreased, while Th2 cytokines IL-4, IL-6, elevated level IL-10.
At the same time through the co culture of the same source of DC and CD4+T from different sources found the source of the same DC and different sources of CD4+T co culture in this experiment to produce cytokines had no significant effect, further proof of DC whether OPN secreted plays a crucial role in the response of T cells induced by DC process.
Through human PBMC culture and osteopontin neutralization antibody blocking osteopontin function, we found that osteopontin antibody reduced the level of CD80 and CD86 on DC surface, and maintained the same trend after HBV antigen stimulation, indicating that the maturation of DC was inhibited after the function of osteopontin was blocked.
Through human PBMC culture and osteopontin neutralization antibody to block the function of osteopontin, it is found that after blocking the function of osteopontin, it can cause DC to secrete IL-12 function decline, while Thl type cytokine IFN-a secretion decreases, while Th2 type cytokine secretion level rises.
conclusion
1.DC can secrete a large number of Osteopontin during development and maturation, and osteopontin plays an important role in the development and maturation of DC.
The lack or deficiency of 2. osteopontin inhibits the expression of CD80 and CD86 molecules on the surface of DC after HBV antigen stimulation, which inhibits the maturation of DC.
The lack or deficiency of 3. osteopontin leads to a decrease in the level of DC secretory cytokines after HBV antigen stimulation, and the secretory function is affected.
4., deficiency or deficiency of osteopontin leads to the defect of DC phenotype and function, which inhibits DC activation induced by HBV antigen and induces Thl cell activation, resulting in imbalance of Th1/Th2 cytokines, thereby affecting DC in the process of HBV infection.

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R373

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