本文關(guān)鍵詞： 急性移植排斥反應(yīng) MHC-Ⅰ 膜蛋白 外周血 淋巴細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 器官移植是20世紀(jì)偉大的科學(xué)創(chuàng)舉,器官移植的廣泛開展挽救了無數(shù)終末期器官功能衰竭患者的生命。然而,器官移植技術(shù)仍存在諸多問題,使得移植后的器官不能正常發(fā)揮功能。移植后的急性排斥反應(yīng)(AGR)是移植物功能降低甚至喪失的主要原因,也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)的主要因素。盡早及時(shí)的發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng),并采取有效的措施加以控制,可挽救移植物或延長移植物壽命。 目前移植物的病理組織學(xué)檢查仍然是判斷急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而,由于病理組織學(xué)檢查存在創(chuàng)傷性、操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、不適合重復(fù)操作等缺點(diǎn),不能作為臨床常規(guī)檢查手段。目前常用的一些無創(chuàng)性檢查方法,包括影像學(xué)、生化學(xué)檢查以及抗體檢測等,由于其在準(zhǔn)確性、敏感性、特異性方面的不足而沒能廣泛應(yīng)用于臨床。至今為止,沒有一種用于判斷急性排斥反應(yīng)的簡單、無創(chuàng)性的檢查方法獲得大家的認(rèn)可。 主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC),是位于哺乳動(dòng)物某一染色體的一組緊密連鎖的基因群,其產(chǎn)物的主要作用是參與抗原遞呈和T細(xì)胞激活,在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中執(zhí)行重要而廣泛的功能。人類MHC又稱人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體(human leucocyte antigen, HLA)。經(jīng)典的MHC分子具有高度的多態(tài)性,正是由于移植供受者間這種MHC分子的不匹配導(dǎo)致了移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。也就是說MHC是啟動(dòng)移植排斥反應(yīng)的靶抗原,是移植免疫的主角。在移植免疫研究領(lǐng)域,人們往往把目光集中在移植物MHC分子以及宿主血清中針對移植物的抗體上。但作為體內(nèi)表達(dá)MHC-Ⅰ類分子最豐富的細(xì)胞,淋巴細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子的功能研究卻較少見。已有研究表明,外周血淋巴細(xì)胞表面HLA-A、B mRNA以及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)隨年齡老化而降低,可以作為機(jī)體免疫功能衰退的指標(biāo)；CD4+T細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子可以延長CD4+T細(xì)胞的存活時(shí)間；記憶性T細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子的表達(dá)對其自身具有保護(hù)作用。我們前期工作利用RNAi技術(shù)封閉淋巴細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子,發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的增殖和殺傷活性均降低。另外我們前期對近交系小鼠皮膚移植模型的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)小鼠外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ基因中的H-2K、H-2D基因轉(zhuǎn)錄mRNA表達(dá)升高。那么MHC-Ⅰ蛋白作為行使功能的分子,與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系如何?以及其在臨床上的應(yīng)用如何?CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞哪個(gè)亞群細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)更能代表急性排斥反應(yīng)的發(fā)生?MHC-Ⅰ蛋白和MHC-ImRNA兩者誰更利于急性排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)?類似問題有待于我們進(jìn)一步研究。 為了系統(tǒng)的研究MHC-Ⅰ分子在急性移植排斥反應(yīng)全過程中的變化規(guī)律,本研究首先采用近交系小鼠皮膚移植模型,研究了移植前、移植后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血淋巴細(xì)胞MHC-ImRNA的表達(dá)及外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群MHC-K、移植物MHC-Ⅰ分子的表達(dá)變化,分析了MHC-Ⅰ分子的表達(dá)水平與移植排斥全過程的對應(yīng)關(guān)系。進(jìn)而動(dòng)態(tài)監(jiān)測了臨床上包括移植術(shù)后穩(wěn)定和移植術(shù)后發(fā)生急性排斥的共53例腎移植患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞MHC-Ⅰ分子的表達(dá)情況,從動(dòng)物和臨床兩方面探討了MHC-Ⅰ作為判斷急性移植排斥反應(yīng)指標(biāo)的可行性。 目的 1.構(gòu)建近交系小鼠皮膚移植模型,從而獲得急性移植排斥反應(yīng)的全過程,研究急性移植排斥反應(yīng)時(shí)外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)規(guī)律,探討外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)與急性移植排斥反應(yīng)病理分級之間的對應(yīng)關(guān)系。 2.對外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ基因的mRNA和蛋白兩個(gè)水平進(jìn)行研究,分析兩水平表達(dá)趨勢是否一致,哪一個(gè)水平的表達(dá)變化更能反映急性移植排斥反應(yīng)。 3.分別檢測CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子的表達(dá)變化,分析MHC-Ⅰ分子的表達(dá)變化在兩群細(xì)胞間是否存在差別。 4.與T細(xì)胞活化指標(biāo)MHC-Ⅱ比較,探討MHC-Ⅰ分子作為判斷急性移植排斥反應(yīng)的可行性。 5.動(dòng)態(tài)檢測腎移植患者術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間外周血單個(gè)核細(xì)胞HLA-I mRNA表達(dá)變化以及CD3+CD4+細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞HLA-Ⅰ蛋白水平的表達(dá)變化,對比排斥組和穩(wěn)定組之間的差異,進(jìn)一步探討在臨床腎急性移植排斥反應(yīng)中HLA-I的診斷價(jià)值。 方法 1.實(shí)驗(yàn)小鼠分組：把270只BALB/C(簡稱BA)小鼠隨機(jī)分為三組,分別是移植用藥組(應(yīng)用免疫抑制劑)、移植未用藥組以及單純感染組。用藥組和未用藥組又分為非手術(shù)組、同系移植組和異系移植組。用藥非手術(shù)組即為用藥術(shù)前對照組,未用藥非手術(shù)組即為未用藥術(shù)前對照組。用藥組的設(shè)立是為了模擬臨床采用了皮質(zhì)激素(Horm)、環(huán)孢素A(CsA)及霉酚酸酯(MMF)中等劑量三聯(lián)用藥。采用腸球菌注射正常小鼠腹腔建立腸球菌小鼠腹膜炎模型既為細(xì)菌感染組。同系移植采用BA小鼠個(gè)體之間進(jìn)行皮膚移植,異系移植以C57BL/6(簡稱C57)小鼠為供體,BA小鼠為受體,進(jìn)行小鼠皮膚移植。每兩天為一個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別為術(shù)后2、4、6天……,用藥移植組小鼠觀察到術(shù)后26天,未用藥移植組小鼠觀察到術(shù)后16天。 2.構(gòu)建小鼠皮膚移植模型以及標(biāo)本的留�。阂訡57小鼠為供體,BA小鼠為受體,采用經(jīng)典的小鼠背—背皮膚移植手術(shù)方法,建立小鼠皮膚移植動(dòng)物模型。移植后每隔一天(每兩天)對小鼠狀態(tài)進(jìn)行全面分析,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只小鼠,進(jìn)行以下操作：記錄移植前和移植術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)小鼠移植皮片的肉眼變化；通過眼球取血采集小鼠血液到EDTA-K2抗凝血常規(guī)管中備用；采血的同時(shí)取移植皮片組織用4%多聚甲醛固定,用于組織病理學(xué)檢測和免疫組化檢測。對正常組和細(xì)菌感染組小鼠收集血液備用。 3.小鼠血液標(biāo)本的檢測：采用三色流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠外周血不同亞群T細(xì)胞：CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞MHC-ⅠmRNA,MHC-ⅡmRNA的表達(dá)變化；分析外周血淋巴細(xì)胞MHC-ⅠMHC-Ⅱ在AGR全過程中的變化規(guī)律,以及免疫抑制劑對上述指標(biāo)表達(dá)水平的影響。 4.小鼠移植皮片標(biāo)本的檢查：對留取的所有時(shí)間點(diǎn)的皮膚組織進(jìn)行常規(guī)病理切片,H-E染色后觀察移植皮片淋巴細(xì)胞浸潤等組織學(xué)變化,根據(jù)病理組織學(xué)改變將術(shù)后不同天數(shù)的移植物排斥反應(yīng)發(fā)生的程度分為Ⅰ-Ⅳ級,記錄移植物病理排斥動(dòng)態(tài)變化。對比用藥和不用藥對移植物病理組織學(xué)改變和存活時(shí)間的影響。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測小鼠移植皮片中組織細(xì)胞和浸潤淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá),觀察急性移植排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)小鼠移植皮片中MHC-Ⅰ表達(dá)強(qiáng)度的變化。 5.臨床腎移植患者：根據(jù)移植術(shù)后3個(gè)月之內(nèi)是否發(fā)生過急性移植排斥反應(yīng),把腎移植患者分成穩(wěn)定組和排斥組。收集腎移植穩(wěn)定組患者術(shù)前和術(shù)后3天、7天……3月和大于3個(gè)月的血液標(biāo)本和腎移植排斥組患者排斥前、排斥當(dāng)天、抗排斥治療后3天、7天、14天的血液標(biāo)本,采用流式細(xì)胞技術(shù)對外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞表面的HLA-Ⅰ(MHC-Ⅰ)分子進(jìn)行檢測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對外周血淋巴細(xì)胞HLA-ImRNA進(jìn)行檢測。比較穩(wěn)定組和排斥組的差異,初步從臨床角度評價(jià)HLA-Ⅰ對于急性移植排斥反應(yīng)的診斷價(jià)值。結(jié)果 1.移植皮片的肉眼及病理組織學(xué)結(jié)果 95%小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中都有體重增長,其余5%在實(shí)驗(yàn)中被排除。同系移植組小鼠皮膚移植物生長良好,移植物縫合部位逐漸愈合,皮片柔軟紅潤。在異系未用藥組和異系用藥組,移植物逐漸變暗、變黑,80%移植物壞死時(shí)發(fā)生在術(shù)后第10天和第22天。移植皮片經(jīng)H-E染色,按照淋巴細(xì)胞浸潤和皮膚組織壞死程度將急性排斥反應(yīng)分為輕度(Ⅰ級)、中度(Ⅱ級)、重度(Ⅲ級)和極重度(Ⅳ級)四個(gè)等級。結(jié)果顯示：隨術(shù)后時(shí)間的延長,異系移植皮片淋巴細(xì)胞浸潤逐漸增強(qiáng)。不用藥情況下,病理Ⅰ-Ⅳ級排斥反應(yīng)分別發(fā)生于術(shù)后2-4天、4-8天、8-12天和12-16天。用藥情況下,淋巴細(xì)胞浸潤時(shí)間延遲,病理排斥Ⅰ-Ⅳ級分別發(fā)生于2-8天、8-14天、14-20天、20-26天。同系移植皮片中很少淋巴細(xì)胞浸潤,移植病理分級為0或Ⅰ級。 2.未用藥情況下,移植術(shù)后MHC-Ⅰ的表達(dá)變化 同系移植組,術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)外周血、皮膚移植物MHC-Ⅰ的表達(dá)變化不明顯,與術(shù)前基本保持一致,而異系移植組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出不同的變化。 外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)情況：CD3+CD8+細(xì)胞MHC-Ⅰ膜蛋白在術(shù)后6天表達(dá)明顯升高,表達(dá)強(qiáng)度約為術(shù)前的1.3倍(MFI從術(shù)前219升高到290),升高一直持續(xù)到術(shù)后12天,術(shù)后14天MHC-Ⅰ膜蛋白表達(dá)回復(fù)到術(shù)前水平,升高的時(shí)段與病理Ⅱ-Ⅲ級對應(yīng)；CD3+CD4+細(xì)胞MHC-Ⅰ膜蛋白升高開始的時(shí)間比CD3+CD8+細(xì)胞早2天,但其表達(dá)趨勢和表達(dá)強(qiáng)度與CD3+CD8+細(xì)胞基本一致；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測MHC-ImRNA表達(dá)與流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+細(xì)胞MHC-Ⅰ膜蛋白表達(dá)規(guī)律一致。異系移植術(shù)后4天,外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)明顯升高,術(shù)后6天達(dá)峰值,約為術(shù)前的4倍(從術(shù)前1.38升高到5.96),表達(dá)升高一直持續(xù)到術(shù)后12天,術(shù)后14天恢復(fù)到術(shù)前水平。 免疫組化檢測結(jié)果：所有小鼠移植皮片組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤淋巴細(xì)胞均呈陽性表達(dá),但當(dāng)排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí),移植物MHC-Ⅰ表達(dá)明顯增強(qiáng)。3.應(yīng)用免疫抑制劑情況下,移植術(shù)前及術(shù)后MHC-Ⅰ的表達(dá)變化 在移植手術(shù)前,與未用藥相比,用藥后MHC-ⅠmRNA及蛋白表達(dá)水平降低,說明免疫抑制劑對MHC-Ⅰ的表達(dá)有抑制作用。同系移植組,術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)外周血、皮膚移植物MHC-Ⅰ的表達(dá)變化不明顯,與術(shù)前基本保持一致。而異系移植組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出不同的變化。 外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)情況：CD3+CD8+細(xì)胞MHC-Ⅰ膜蛋白在術(shù)后12天表達(dá)明顯升高,術(shù)后16天達(dá)峰值,表達(dá)強(qiáng)度約為術(shù)前的1.3倍(MFI從術(shù)前169升高到228),升高一直持續(xù)到術(shù)后22天,術(shù)后24天MHC-Ⅰ膜蛋白表達(dá)回復(fù)到術(shù)前水平,升高的時(shí)段與病理Ⅱ-Ⅲ級對應(yīng)；MHC-Ⅰ膜蛋白在CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞上表達(dá)趨勢和表達(dá)強(qiáng)度基本一致,CD3+CD4+細(xì)胞MHC-Ⅰ升高開始的時(shí)間比CD3+CD8+細(xì)胞早4天；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測mRNA表達(dá)與流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD4+細(xì)胞膜蛋白表達(dá)趨勢一致。異系移植術(shù)后8天,外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)開始升高,術(shù)后16天達(dá)峰值,相對表達(dá)量約為術(shù)前的9倍(從術(shù)前0.58上升為5.76),然后逐漸下降到術(shù)后24天恢復(fù)到術(shù)前水平。 免疫組化檢測結(jié)果：所有小鼠皮片組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤淋巴細(xì)胞均呈陽性表達(dá),與未用藥組比較,表達(dá)強(qiáng)度減弱。但當(dāng)急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí),移植物MHC-Ⅰ表達(dá)增強(qiáng)。4.感染組小鼠外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達(dá)變化 與正常對照組相比,感染組小鼠在腹腔注射腸球菌8小時(shí)時(shí),外周血白細(xì)胞總數(shù)升高,外周血淋巴細(xì)胞MHC-ⅡmRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng),但外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ無論在mRNA水平還是蛋白水平的表達(dá)都沒有明顯的變化,說明感染性疾病不影響MHC-Ⅰ的表達(dá)。 5.外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ在急性移植排斥反應(yīng)過程中表達(dá)變化的比較 外周血淋巴細(xì)胞MHC-ⅡmRNA表達(dá)：在同系移植組,術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)MHC-Ⅱ表達(dá)與術(shù)前相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在未用藥組,MHC-Ⅱ在術(shù)后4天開始升高,術(shù)后6天達(dá)峰值,約為術(shù)前的2.1倍(從術(shù)前1.29升高到2.71),術(shù)后14天降到術(shù)前水平。應(yīng)用免疫抑制劑的情況下,MHC-Ⅱ在術(shù)后8天開始升高,術(shù)后24天恢復(fù)術(shù)前水平。與MHC-Ⅰ表達(dá)相比,MHC-Ⅱ升高幅度較小。外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅱ膜蛋白的表達(dá)：在未用藥組,僅在術(shù)后6天和8天時(shí)升高,在用藥組,僅在術(shù)后12、14、16天表達(dá)升高,與MHC-Ⅰ相比,升高開始時(shí)間晚、升高持續(xù)時(shí)間短。 6.腎移植患者術(shù)前、術(shù)后以及發(fā)生移植排斥時(shí)MHC-Ⅰ表達(dá)變化穩(wěn)定組：CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞HLA-Ⅰ膜蛋白表達(dá)趨勢相同。術(shù)后一周內(nèi)淋巴細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)稍有升高,升高幅度較小,約為術(shù)前的1.3倍,到術(shù)后2周時(shí),恢復(fù)到術(shù)前水平。外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平與膜蛋白水平趨勢相同,但變化幅度較小。 排斥組：與排斥前最后一次隨訪檢測的HLA-Ⅰ表達(dá)水平相比,在排斥發(fā)生的當(dāng)天,HLA-Ⅰ表達(dá)明顯升高(排斥當(dāng)天308.2 vs.術(shù)前110.9),約為術(shù)前的2.7倍。應(yīng)用免疫抑制劑沖擊治療3天后,HLA-Ⅰ表達(dá)明顯下降,7天后,HLA-Ⅰ表達(dá)逐漸降低到術(shù)前水平。 反復(fù)發(fā)生排斥反應(yīng)的患者HLA-Ⅰ始終處于高表達(dá)水平,免疫抑制劑沖擊治療對HLA-Ⅰ的表達(dá)影響較小。 結(jié)論 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在急性移植排斥的早期階段,病理顯示Ⅱ-Ⅲ級時(shí),外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ蛋白和mRNA水平表達(dá)升高。與MHC-Ⅱ相比,MHC-Ⅰ表達(dá)升高開始時(shí)間早、升高持續(xù)時(shí)間長,升高變化幅度大。MHC-Ⅰ蛋白和(?)nRNA水平的表達(dá)變化均能及時(shí)預(yù)測急性移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。 2.臨床應(yīng)用進(jìn)一步證實(shí)腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí),外周血淋巴細(xì)胞HLA-Ⅰ蛋白和mRNA水平表達(dá)升高,尤其是膜蛋白水平表達(dá)升高更為明顯。外周血淋巴細(xì)胞表面膜蛋白HLA-Ⅰ水平可作為診斷急性移植排斥反應(yīng)發(fā)生的無創(chuàng)性檢測指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1444861