本文關(guān)鍵詞： 血小板源性生長(zhǎng)因子 香煙煙霧 肺動(dòng)脈 平滑肌 血管 肺血管重塑 香煙煙霧 血小板源性生長(zhǎng)因子 肺動(dòng)脈 平滑肌 細(xì)胞增殖 香煙煙霧 血小板源性生長(zhǎng)因子 蛋白激酶C 肺動(dòng)脈平滑肌　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分煙霧暴露大鼠肺血管血小板源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)及其與肺血管重塑的關(guān)系 目的 觀察煙霧暴露大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化、壓力變化及血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGFB/PD GFR-p)表達(dá)變化,探討煙霧暴露致大鼠肺血管重塑中PDGFB/PDGFR-β的表達(dá)變化及其意義。 方法 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、煙霧暴露1月組(S1m)、煙霧暴露2月組(S2m)、煙霧暴露3月組(S3m),建立煙霧暴露大鼠模型,檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓(Pa02)、平均右心室收縮壓(mRVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI),HE染色觀察肺動(dòng)脈組織學(xué)改變并測(cè)量肺小動(dòng)脈管壁面積/管總面積(WA%),Masson染色檢測(cè)肺動(dòng)脈壁膠原增殖,透射電鏡觀察肺小動(dòng)脈的超微結(jié)構(gòu),免疫組織化學(xué)染色法觀察肺動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR). Western-blotting檢測(cè)肺動(dòng)脈PDGFB/PDGFR-β mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1.C組、S1m、S2m及S3m組PaO2值分別為(96.2±4.3)、(92.1±5.2)、(90.5±4.1)及(89.6±4.8) mmHg,各組間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 2.S3m組mRVSP及RVHI值為(65.63±5.6,54.79+7.13)與C組(14.07±4.18,32.41±0.26)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；S1m組(16.85±1.26,36.62±1.321、S2m組(23.57±4.51,40.23±2.12)與C組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 3.C組、S1m、S2m及S3m組WA%值分別為(31.29±1.95)%、(42.68±2.24)%、(51.844±2.38)%、(62.11±1.39)%,隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),WA%呈時(shí)間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 4.C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈管壁膠原厚度分別為(4.67±0.36)μm、(8.96±1.80)μm、(11.8±2.12)μm、(15.3±1.65)μm。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),肺動(dòng)脈管壁膠原沉積呈時(shí)間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 5.肺小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察：C組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常,胞外未見膠原纖維增生,平滑肌細(xì)胞未見增生。S1m組肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則,內(nèi)膜增厚,細(xì)胞內(nèi)可見線粒體腫脹,平滑肌細(xì)胞輕度增生。S2m組內(nèi)彈力膜厚薄不均,平滑肌走向不規(guī)則,膠原纖維增生。S3m組肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)層次紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞變形嚴(yán)重,膠原纖維大量增生。 6.C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈α-SMA表達(dá)量分別為(37.5±7.5)、(52.6±14.3)、(72.2±13.6)、(98.1±15.6),隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),肺動(dòng)脈α-SMA表達(dá)量呈時(shí)間依賴性增加,與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)；煙霧暴露各組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 7.肺動(dòng)脈PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表達(dá)的比較 (1)C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈PDGFB mRNA表達(dá)量分別為(0.31±0.09)、(0.35±0.02)、(0.42±0.01)、(0.55±0.03),隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),肺動(dòng)脈PDGFB mRNA表達(dá)量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 (2)C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈PDGFB蛋白表達(dá)量分別為(1.38+0.04)、(1.50±0.02)、(1.58±0.06)、(1.44±0.02)；隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),PDGFB蛋白表達(dá)量增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 (3)C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈PDGFR-β mRNA表達(dá)量分別為(0.21±0.09)、(0.41±0.02)、(0.61±0.03)、(0.83±0.08)；隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),PDGFR-β mRNA表達(dá)量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 (4)C組、S1m、S2m及S3m組肺動(dòng)脈PDGFR-β蛋白表達(dá)量分別為(1.23±0.01)、(1.50+0.01)、(1.38±0.02)、(1.57±0.04)；隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),PDGFR-β蛋白表達(dá)量增加。煙霧暴露各組與C組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 8.相關(guān)性分析mRVSP與RVHI成正相關(guān)(r=0.713,P0.05)；PDGFB mRNA及蛋白表達(dá)量與WA%均呈止相關(guān)(分別為r=0.941,r=0.605,均P0.05)；PDGFR-β mRNA及蛋白表達(dá)量與WA%均呈正相關(guān)(分別為r=0.936,r=0.820,均P0.05)；PDGFB與PDGFR-β mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.921,P0.05)；PDGFB與PDGFR-β蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.379,P0.05)。 結(jié)論 1.煙霧暴露可使肺血管形態(tài)發(fā)生明顯改變,肺小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)異常,導(dǎo)致肺血管重塑,肺血流阻力增加,右心室收縮壓升高。 2.煙霧暴露上調(diào)大鼠肺動(dòng)脈PDGFB/PDGFR-β表達(dá),PDGFB/PDGFR-β在肺血管重塑、肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中起重要作用。 第二部分血小板源性生長(zhǎng)因子在香煙煙霧提取物介導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的表達(dá)變化 目的 探討香煙煙霧提取物(CSE)對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rPASMCs)增殖的影響及血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGFB/PDGFR-β)在其中的作用。 方法 1.培養(yǎng)rPASMCs,不同濃度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小時(shí),四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)rPASMCs增殖,流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化。 2.不同濃度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小時(shí),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western-blotting分別檢測(cè)PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表達(dá)。 3. rPASMCs與不同濃度PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)(1μM/L,2μM/L,4μM/L,8μM/L)預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),MTT法觀察細(xì)胞增殖的變化。 4. rPASMCs與PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)8μM預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),Western-blotting檢測(cè)PDGFB/PDGFR-β蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1.CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs MTT吸光度(A)值分別為(1.839±0.128)、(2.241±0.182)、(2.951±0.072)、(4.329±0.176),與對(duì)照組(0.977±0.156)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(17.08±0.31)、(18.47±0.21)、(23.19±0.16)、(23.71±0.29),與對(duì)照組(13.04±2.39)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCsG2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(45.21±5.20)、(47.05±14.14)、(42.05±8.97)、(41.15±6.80),與對(duì)照組(22.77±3.04)比較明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 2.CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB mRNA表達(dá)量分別為(0.647±0.035)、(0.819±0.065)、(0.776±0.046)、(0.623±0.048),與對(duì)照組(0.411±0.026)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；CSE各組PDGFR-β mRNA表達(dá)量分別為(0.393±0.021)、(0.739±0.034)、(0.745±0.032)、(0.620±0.019),與對(duì)照組(0.411±0.011)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；CSE各組(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB蛋白表達(dá)量分別為(0.367±0.015)、(0.716±0.033)、(0.897±0.041)、(1.202±0.039),與對(duì)照組(0.544±0.025)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；PDGFR-β蛋白表達(dá)量分別為(0.718±0.019)、(0.920±0.039)、(0.998±0.081)、(1.061±0.057),與對(duì)照組(0.585±0.026)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 3.10%CSE組MTT(A)值(2.643±0.099)增高,與對(duì)照組(0.856±0.017)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；10%CSE+Imatinib各組(1μtM/L,21μM/L,41μM/L,8μM/L)(A)值均降低,分別為(2.012±0.391)、(1.997±0.379)、(1.458±0.495)、(1.022±0.102),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 4.10%CSE處理后,rPASMCs中PDGFB蛋白表達(dá)量升高(1.662±0.271),與對(duì)照組(0.996±0.181)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；伊馬替尼(Imatinib)十預(yù)后PDGFB蛋白表達(dá)量降低(1.231±0.192),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；10%CSE處理后,rPASMCs中PDGFR-β蛋白表達(dá)量升高(1.581±0.153),與對(duì)照組(0.986±0.131)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；伊馬替尼(Imatinib)干預(yù)后PDGFR-β蛋白表達(dá)量降低(1.211±0.192),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.CSE可誘導(dǎo)rPASMCs增殖。 2.CSE可使rPASMCs周期發(fā)生變化,細(xì)胞由G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制和有絲分裂。 3.CSE誘導(dǎo)PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。 4.CSE誘導(dǎo)PDGFB及PDGFR-β表達(dá)上調(diào),二者存在相關(guān)關(guān)系�？赡芘cPDGF信號(hào)通路配體PDGFB與受體PDGFR-β相互作用有關(guān)。 5. PDGFR阻斷劑可抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs增殖效應(yīng)且對(duì)PDGFB/PDGFR-β表達(dá)上調(diào)有明顯的抑制效應(yīng),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 第三部分蛋白激酶C-δ途徑促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究 目的 探討蛋白激酶C-δ(PKC-δ)在香煙煙霧提取物(CSE)對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rPASMCs)增殖中的影響及其對(duì)PDGFB/PDGFR-β表達(dá)的作用。 方法 1.培養(yǎng)rPASMCs細(xì)胞,rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),MTT法觀察細(xì)胞增殖的變化。 2. rPASMCs與Rottlerin8nM/L預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。 3. rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin (1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測(cè)PKC-δ mRNA和蛋白及pi-PKC-δ蛋白的表達(dá)。 4. rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)預(yù)孵育1小時(shí),然后暴露于10%CSE24小時(shí),采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測(cè)PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1.10%CSE組rPASMCs的MTT(A)值(3.535+0.353)增高,與對(duì)照組(0.873±0.184)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)A值均降低,分別為(2.322±0.358)、(2.227±0.291)、(1.903±0.212)、(0.944±0.109),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。 2.10%CSE組rPASMCs的S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(22.39±1.09)增高,與對(duì)照組(6.51±1.23)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L組S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低為(12.21±1.96),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。10%CSE組rPASMCs的G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(17.12±0.45)增高,與對(duì)照組(4.03±2.96)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L組G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低為(8.59±2.05),與10%CSE組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3.各組PKC-δ mRNA和蛋白表達(dá)變化 (1)各組PKC-δ mRNA和蛋白表達(dá)量：對(duì)照組為(0.955±0.049,0.758±0.131),10%CSE組為(1.068+0.079,0.873±0.011),10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)分別為(1.027±0.113,0.813±0.174)、(0.971±0.118,0.723+0.117)、(0.851±0.065,0.904±0.011)、(0.887±0.053,0.881±0.025),各組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (2)各組pi-PKC-δ蛋白表達(dá)量：10%CSE組(1.485±0.058)增高,與對(duì)照組(0.985±0.009)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)pi-PKC-δ蛋白表達(dá)量下降,分別為(1.257±0.050)、(1.146±0.174)、(1.051±0.019)、(1.006±0.018),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 4. Rottlerin阻斷后各組PDGFB/PDGFR-β表達(dá) (1)各組PDGFB mRNA表達(dá)：10%CSE組(1.245±0.020)增高,與對(duì)照組(0.649±0.046)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB mRNA表達(dá)降低,分別為(1.235±0.086)、(0.722±0.035)、(0.679±0.023)、(0.676±0.035),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 (2)各組PDGFB蛋白表達(dá)：10%CSE組(1.746±0.132)增高,與對(duì)照組(0.654±0.009)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB蛋白表達(dá)降低,分別為(1.322±0.066)、(0.913±0.020)、(0.932±0.219)、(0.918+0.013),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 (3)各組PDGFR-β mRNA表達(dá)：10%CSE組(1.728±0.029)增高,與對(duì)照組(0.973±0.069)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β mRNA表達(dá)降低,分別為(1.225±0.056)、(1.021±0.074)、(0.935±0.051)、(0.745±0.074),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 (4)各組PDGFR-β蛋白表達(dá)：10%CSE組(1.207±0.058)增高,與對(duì)照組(0.657±0.009)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各組,(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β蛋白表達(dá)降低,分別為(1.176±0.050)、(0.848±0.174)、(0.843±0.019)、(0.838±0.018),與10%CSE組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 結(jié)論 1.CSE對(duì)PKC-δ的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯作用。 2.CSE上調(diào)磷酸化PKC-δ蛋白表達(dá),PKC-δ阻斷劑Rottlerin對(duì)磷酸化PKC-δ蛋白表達(dá)上調(diào)有明顯的抑制作用。 3.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs細(xì)胞增殖效應(yīng)。 4.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs細(xì)胞周期變化。 5.PKC-δ阻斷劑Rottlerin對(duì)CSE誘導(dǎo)的PDGFB和PDGFR-β表達(dá)上調(diào)有明顯的抑制作用,CSE通過(guò)激活PKC-δ途徑促進(jìn)rPASMCs細(xì)胞PDGFB/PDGFR-β的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 李豐,張燕,車東媛,鄧仲端;缺氧內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞血小板源性生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)[J];中華病理學(xué)雜志;1998年06期

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本文編號(hào)：1444796