本文關(guān)鍵詞：協(xié)同刺激分子B7-H3兩種異構(gòu)體的基因演化及其生物學功能差異的研究　出處：《蘇州大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：協(xié)同刺激分子是T淋巴細胞活化過程中一類重要的調(diào)節(jié)分子。表達于抗原遞呈細胞(APCs)和T細胞表面的協(xié)同刺激分子對相互作用后,可增強或減弱TCR信號從而調(diào)控T細胞的免疫應答。根據(jù)協(xié)同刺激分子的結(jié)構(gòu)差異其可分為兩類:免疫球蛋白超家族與腫瘤壞死因子超家族,而其中B7家族分子是表達于APCs細胞包括樹突狀細胞、單核細胞、朗格漢斯細胞、巨噬細胞和B細胞表面的協(xié)同刺激配體分子,屬于免疫球蛋白超家族。 協(xié)同刺激分子B7-H3是近年來新發(fā)現(xiàn)的B7家族的成員之一,是Chapoval等人從人樹突狀細胞的cDNA庫中克隆得出,發(fā)現(xiàn)距今僅有十年時間。B7-H3分子與B7家族其它成員不同之處在于小鼠B7-H3分子僅有1種表達形式--2IgB7-H3,該蛋白胞外段擁有一個免疫球蛋白V樣結(jié)構(gòu)域和C樣結(jié)構(gòu)域;而人B7-H3分子存在2種異構(gòu)體:一種體外含有4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域,2個重復并排的VC,命名為4IgB7-H3或B7-H3b;另一異構(gòu)體胞外段含有一個V和一個C,為2IgB7-H3。4IgB7-H3為人大部分細胞和組織中的主要表達形式,其胞外段兩對VC之間堿基重復率為98%,是2IgB7-H3基因復制的結(jié)果。 最初的研究表明B7-H3能刺激CD4+T細胞的增殖,使CTL活性增加,同時提高IFN-γ的分泌和表達,被認為是一正性協(xié)同刺激分子。隨后的研究發(fā)現(xiàn),B7-H3信號可負性調(diào)控T細胞的活化及其介導的免疫應答,因此認為B7-H3可能是一負性協(xié)同刺激分子。該分子生物學功能的爭議可能與其受體未知相關(guān),有研究者報道B7-H3可能與TLT-2分子相結(jié)合介導正性協(xié)同刺激信號,也有研究者否認了此觀點。B7-H3分子的生物學功能的不明確除了與受體未知外,也可能與其存在2種異構(gòu)體相關(guān),不同的異構(gòu)體結(jié)合不同的受體可能發(fā)揮不同的生物學功能,如B7.1與B7.2可與2種受體CD28與CTLA-4相結(jié)合介導相反的生物學功能。 已有的研究表明,多種協(xié)同刺激分子能分別以細胞膜型和可溶型兩種形式存在,包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等�？扇苄苑肿涌梢酝ㄟ^蛋白水解酶裂解細胞上的膜型分子而形成,也可由專一的mRNA直接編碼產(chǎn)生。本實驗室在2008年首次報道可溶性B7-H3(sB7-H3)的存在,其在外周血和腦脊液的表達高低有助于細菌性腦膜炎的診斷,且在非小細胞型肺癌及膿毒血癥具有高表達的臨床意義。但可溶性B7-H3來源于何種異構(gòu)體及其來源的機制尚未明確。 本研究旨在通過生物信息學的研究方法從各類核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中調(diào)取從硬骨魚至哺乳動物各物種B7-H3序列,分析基因結(jié)構(gòu)以預測其異構(gòu)體的表達并通過分子生物學實驗驗證生物信息學預測結(jié)果。繼而通過序列的比對分析和進化樹的構(gòu)建推導4IgB7-H3外顯子復制的模式以指導生物學功能是否存在差異。在分析各物種B7-H3序列過程時我們發(fā)現(xiàn)一段保守性氨基酸,其可成為影響可溶性存在形式的重要序列。蛋白質(zhì)空間構(gòu)象模擬和融合蛋白結(jié)合實驗提示2種異構(gòu)體可結(jié)合不同的受體;繼而通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)人2種異構(gòu)體對T細胞和單核細胞存在不同的生物學功能。 一、B7-H3分子2種異構(gòu)體在不同物種中的分布及其基因復制模式的研究 【目的】探討B(tài)7-H3分子2種異構(gòu)體在不同物種中的分布,回答如下科學問題:為何小鼠僅存1種形式B7-H3分子,而人存在2種。研究4IgB7-H3外顯子復制的模式以輔助研究其與異構(gòu)體2IgB7-H3是否存在生物學功能差異。 【方法】通過生物信息學方法從各類數(shù)據(jù)庫中搜索各物種B7-H3序列,分析結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及剪切形式預測異構(gòu)體的分布;獲取代表性物種組織抽提RNA,PCR驗證預測結(jié)果。構(gòu)建各物種B7-H3的進化樹及對種間、種內(nèi)V區(qū)和C區(qū)的序列進行聚類分析,計算各物種V1C1和V2C2的dN和dS比。 【結(jié)果】獲取了38個物種的B7-H3序列,其中豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊貓、蝙蝠及高級靈長類動物如黑猩猩、大猩猩、猴等物種中存在2種剪切體;RT-PCR方法證實了2種剪切體的表達。聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)高級靈長類動物種間V1C1及V2C2序列相似度大于種內(nèi)V1C1與V2C2。各物種V1C1與V2C2序列的非同義突變(dN)大于同義突變(dS)值。 【結(jié)論】B7-H3分子最早以2IgB7-H3形式存在于硬骨魚動物中;生物信息學及分子生物學方法均證實4IgB7-H3除表達于人類外還可表達于豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊貓、蝙蝠及高級靈長類動物如猩猩、猴體內(nèi)。4IgB7-H3是2IgB7-H3基因復制的結(jié)果,該復制事件并非在各物種中獨立發(fā)生,至少在嚙齒類及靈長類動物種為一種普通復制事件。 二、人2IgB7-H3和4IgB7-H3蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)模擬及其受體表達分析 【目的】通過蛋白質(zhì)同源建模法模擬人2IgB7-H3和4IgB7-H3的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象,分析2種異構(gòu)體在空間構(gòu)象上的差異,為其結(jié)合不同受體提供理論依據(jù)。進而構(gòu)建2種異構(gòu)體的融合蛋白分析其與活化T細胞上未知受體的結(jié)合,并通過竟爭結(jié)合實驗觀察其是否具備結(jié)合不同受體的可能性。 【方法】獲取2IgB7-H3和4IgB7-H3蛋白質(zhì)序列后,去除其信號肽、跨膜區(qū)及胞內(nèi)段,通過PSI-BLAST搜尋同源序列、mgenthreader進行折疊相似搜索;使用Modeller進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬,并進行優(yōu)化。生物素標記2種異構(gòu)體的融合蛋白;通過磁珠分化法從PBMC中獲取CD3+T細胞,PHA體外活化24小時,分別用2種生物素標記的融合蛋白結(jié)合活化T細胞及與用未標記融合蛋白孵育過的活化T細胞結(jié)合,流式細胞儀檢測結(jié)合。 【結(jié)果】B7-H3分子中有222個氨基酸與3bisA(PD-L1)的蛋白質(zhì)氨基酸序列具有36%的同源性,因此以PD-L1晶狀體結(jié)構(gòu)為模板模擬B7-H3分子的空間構(gòu)象。2種異構(gòu)體具備不同的空間結(jié)構(gòu)。2種異構(gòu)體的融合蛋白均可結(jié)合于活化的T細胞上,該結(jié)合可被同種異構(gòu)體的融合蛋白所阻斷;而另一種異構(gòu)體的融合蛋白不影響其結(jié)合。 【結(jié)論】成功模擬人2IgB7-H3和4IgB7-H3兩種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),其具備不同的空間構(gòu)象�；罨腡細胞上可能表達兩種受體與B7-H3的2種異構(gòu)體相結(jié)合。 三、人2IgB7-H3和4IgB7-H3生物學功能差異研究 【目的】利用人2IgB7-H3和4IgB7-H3、小鼠B7-H3的基因轉(zhuǎn)染細胞和融合蛋白,研究B7-H3對活化T細胞的作用及在LPS介導的單核細胞抗感染免疫的功能,尋找其生物學功能的差異。 【方法】分離獲得人外周血PBMC細胞,磁珠分化獲得CD3+T細胞和CD14+單核細胞。在CD3、CD28單抗的存在下,使用不同數(shù)量的人2IgB7-H3和4IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞和不同濃度的融合蛋白作用于活化T細胞,72小時ELISA檢測T細胞增殖情況和細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌情況。在LPS存在下,使用不同數(shù)量的人2IgB7-H3和4IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞和不同濃度的融合蛋白作用于單核細胞,24小時ELISA檢測細胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平。獲得正常小鼠脾臟,研磨磁珠分離獲得CD3+T細胞和CD11b+單核細胞,按上述研究方法分析對小鼠T細胞和單核細胞作用。 【結(jié)果】人2IgB7-H3與小鼠B7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞對體外培養(yǎng)3天的T細胞具有促進增殖、活化,增強IL-2、IFN-γ的分泌,與對照相比具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。以上2種基因轉(zhuǎn)染細胞在LPS介導下明顯增強單核細胞的活化,增加IL-6、TNF-α的分泌。人4IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞對體外培養(yǎng)3天的T細胞具有抑制增殖、活化,降低IL-2、IFN-γ的分泌,對單核細胞無明顯生物學作用。 【結(jié)論】活化T細胞上可表達兩種受體與B7-H3相結(jié)合。人2IgB7-H3與小鼠B7-H3與刺激性受體相結(jié)合,發(fā)揮促進T細胞的活化與增強單核細胞的功能;而人4IgB7-H3可與抑制性受體結(jié)合對T細胞的活化具有抑制作用。 四、人4IgB7-H3分子“PQRSPT”基序的生物學特性的研究 【目的】分析序列高度重復的人4IgB7-H3與2IgB7-H3兩種異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)域的差異,并探討該差異與可溶性B7-H3的產(chǎn)生及介導的生物學功能中的相關(guān)性。 【方法】通過氨基酸序列比對方法分析人4IgB7-H3與2IgB7-H3兩種異構(gòu)體的序列差異,并通過拼接PCR的方法獲得表達缺失6個保守性氨基酸(PQRSPT)的4IgB7-H3-Del基因。將該目的片段雙酶切后與pIRES2-EGFP真核表達載體連接,構(gòu)建重組真核表達載體pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-Del并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導入L929細胞;RT-PCR、流式細胞術(shù)和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞B7-H3的表達;Western blot和ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中sB7-H3的表達。將不同濃度的4IgB7-H3-Del轉(zhuǎn)染細胞與活化T細胞共同作用,72小時后CCK-8檢測T細胞增殖情況,ELISA檢測細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌水平。 【結(jié)果】酶切和測序結(jié)果均證實插入的目的基因序列正確,成功構(gòu)建真核表達載體并獲得4IgB7-H3-Del基因轉(zhuǎn)染細胞;流式細胞術(shù)、ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明,4IgB7-H3轉(zhuǎn)染細胞表面高表達B7-H3蛋白,細胞培養(yǎng)上清中無sB7-H3蛋白,而4IgB7-H3-Del轉(zhuǎn)染細胞高表達B7-H3蛋白,其培養(yǎng)上清中有大量sB7-H3的存在。4IgB7-H3-Del轉(zhuǎn)染細胞對活化的T細胞無明顯作用,與對照相比無統(tǒng)計學差異。 【結(jié)論】成功構(gòu)建4IgB7-H3-Del基因轉(zhuǎn)染細胞,其保守性氨基酸“PQRSPT”成為人4IgB7-H3不能形成可溶性形式及發(fā)揮T細胞抑制作用的重要結(jié)構(gòu)域。 綜上所述,本研究通過生物信息學結(jié)合分子生物學的方法探討B(tài)7-H3分子2種異構(gòu)體在不同物種中的分布表達,繼而通過分子聚類和序列分析探討4IgB7-H3外顯子復制的可能模式和目的。通過研究發(fā)現(xiàn)在外顯子復制過程中產(chǎn)生的保守性氨基酸“PQRSPT”可成為人4IgB7-H3不能形成可溶性形式及對活化T細胞產(chǎn)生抑制作用的重要基序。蛋白質(zhì)建模發(fā)現(xiàn)氨基酸高度重復的2種異構(gòu)體具備不同的空間構(gòu)象,融合蛋白結(jié)合實驗推測其可結(jié)合不同的受體發(fā)揮生物學功能。體外實驗對活化T細胞和單核細胞的作用證實了第二部分的實驗結(jié)果。人2IgB7-H3與小鼠B7-H3基因可促進活化T細胞的增殖,增強單核細胞的作用;人4IgB7-H3主要表達于抗原遞逞細胞中可發(fā)揮介導抑制T細胞活化的生物學功能。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 ;Soluble Mouse B7-H3 Down-Regulates Dendritic Cell Stimulatory Capacity to Allogenic T Cell Proliferation and Production of IL-2 and IFN-γ[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年03期

2 殷志祥;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測方法的研究進展[J];計算機工程與應用;2004年20期

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本文編號：1441008