本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)沉默銅綠假單胞菌外排泵基因mexB的蛋白表達(dá)　出處：《華中科技大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 觀察siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌后， MexB蛋白表達(dá)量的變化。 方法： 針對mexB基因設(shè)計合成特異性siRNA分子，與pGPU6/GFP/Neo載體連接，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重組質(zhì)粒。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b+/mexB，，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）plysS，誘導(dǎo)表達(dá)MexB蛋白，蛋白純化后免疫家兔制備多克隆抗體。siRNA質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌野生株、臨床耐藥株及mexB基因高表達(dá)株，運(yùn)用western blot觀察轉(zhuǎn)化8h、12h、24h后，MexB蛋白表達(dá)量的變化。 結(jié)果： 成功構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重組質(zhì)粒。成功表達(dá)銅綠假單胞菌外排泵蛋白MexB，并制備多克隆兔抗。siRNA質(zhì)粒對銅綠假單胞菌野生菌、臨床耐藥株及mexB基因高表達(dá)株的mexB基因均具有良好的沉默效果，而且沉默效果存在時間差異性。 結(jié)論： siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化三株銅綠假單胞菌后，在8h及12h時均可觀察到MexB蛋白表達(dá)量明顯減少，而在24h時MexB蛋白表達(dá)量無改變。其原因可能是由于細(xì)菌內(nèi)存在限制性核酸內(nèi)切酶，能降解異源DNA，這一機(jī)制可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)的siRNA重組質(zhì)粒被迅速降解，使基因沉默時間縮短。
[Abstract]:Objective: To observe the change of MexB protein expression after siRNA interference plasmid was transferred into Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). Methods: The specific siRNA molecule was designed and synthesized for mexB gene and was linked to pGPU6/GFP/Neo vector. Construction of pGPU6/GFP/Neo-siRNA recombinant plasmid, construction of recombinant expression plasmid pET22b / mexB, and transformation of Escherichia coli BL21(DE3)plysS. MexB protein was induced and purified and the polyclonal antibody. SiRNA plasmids were prepared by electrotransformation of Pseudomonas aeruginosa wild-strain, clinically resistant strain and high expression strain of mexB gene. Western blot was used to observe the expression of MexB protein. Results: The recombinant plasmid of pGPU6/GFP/Neo-siRNA was successfully constructed and the efflux pump protein MexB of Pseudomonas aeruginosa was successfully expressed. The polyclonal rabbit anti-. siRNA plasmid had good silencing effect on mexB gene of Pseudomonas aeruginosa, clinical resistant strain and high expression strain of mexB gene. And silence effect exists time difference. Conclusion: After three strains of Pseudomonas aeruginosa were transformed with siRNA plasmid, the expression of MexB protein was significantly decreased at 8h and 12h. However, the expression of MexB protein did not change at 24 h, which may be due to the existence of restriction endonuclease in bacteria, which can degrade heterologous DNA. This mechanism may lead to the rapid degradation of siRNA recombinant plasmid transformed into bacteria and shorten the gene silencing time.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378.991;Q78

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