本文關(guān)鍵詞：PKC-ζ活化在SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移中作用的初步研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：各種戰(zhàn)創(chuàng)傷會(huì)造成機(jī)體體表損傷和器官功能損害,使機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂、感染、出血、疼痛等,甚至休克死亡。在變化不定的外環(huán)境中,人體最大的器官皮膚能夠有效抵御有害物質(zhì)入侵,保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,維持機(jī)體各種正常功能。機(jī)體體表受損時(shí),盡快覆蓋創(chuàng)面和加速創(chuàng)面愈合有助于機(jī)體免于脫水、損傷和進(jìn)一步感染。皮膚創(chuàng)面愈合是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)共同參與的復(fù)雜過程。一般分為三個(gè)階段:1、炎性反應(yīng)階段。2、細(xì)胞遷移增殖,肉芽組織形成階段。3、創(chuàng)面重塑改建階段。研究創(chuàng)面愈合過程的機(jī)理一直以來是戰(zhàn)創(chuàng)傷研究的熱點(diǎn)。 在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究中,表皮干細(xì)胞(epidermal stem cell,ESC)日益受到人們的重視。表皮干細(xì)胞是位于皮膚表皮基底層,具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的一類細(xì)胞。數(shù)量約占表皮基底層的1%~10%。是皮膚發(fā)生、修復(fù)、改建的主要功能細(xì)胞。它維持皮膚新陳代謝,在創(chuàng)傷形成后,它會(huì)代償性增殖和定向分化來參與損傷修復(fù)。表皮干細(xì)胞從創(chuàng)緣向創(chuàng)面中心增殖分化覆蓋創(chuàng)面的過程就是創(chuàng)傷后的創(chuàng)面上皮化過程。創(chuàng)面上皮化在創(chuàng)面愈合中尤為重要。更好更快的促進(jìn)表皮干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)功能是加快創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。 干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)功能從原位進(jìn)入到靶位遷移運(yùn)動(dòng)的過程受趨化因子/趨化因子受體系統(tǒng)調(diào)控。間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)和其特異性受體趨化因子亞家族CXC成員CXCR4共同組成SDF-1/CXCR4軸,廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中,參與胚胎造血遷移、胚胎發(fā)育、造血生成、組織再生重塑、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及創(chuàng)面愈合等一系列生理、病理過程的調(diào)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子SDF-1的特異性受體CXCR4在表皮細(xì)胞表達(dá),并且在越靠近表皮基底膜部位細(xì)胞胞膜表達(dá)水平越高,在急性創(chuàng)傷傷口及創(chuàng)緣部位的SDF-1分泌量較慢性創(chuàng)面明顯增多,SDF-1在受損組織部位的基因和蛋白表達(dá)比正常皮膚組織高。對(duì)三維皮膚等價(jià)物全層皮膚創(chuàng)面模型觀察發(fā)現(xiàn),創(chuàng)緣部位SDF-1的量增多時(shí),創(chuàng)緣基底層β1整合素表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量增多且向表層遷移積聚,說明SDF-1通過作用受體CXCR4趨化表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣遷移,參與創(chuàng)面的修復(fù)。但是SDF-1通過作用CXCR4趨化ESC遷移的信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制仍不十分明確。 研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)能夠上調(diào)SDF-1的表達(dá)。PKC是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。包含有三個(gè)亞家族:cPKC (classical PKC,包括α、β1、β2、γ亞類);nPKC (novel PKC,包括δ、ε、η、θ亞類);aPKC( atypical PKC,包括ι/λ、ζ亞類)。PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路,PKC作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。PKC通過催化絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)底物磷酸化,轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào),在細(xì)胞信號(hào)作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長、增殖、分化、凋亡和遷移運(yùn)動(dòng)。 不同的PKC亞型的結(jié)構(gòu)功能是不同的。研究表明,在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)中PKC-α的表達(dá)水平增高。PKC-α被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移啟動(dòng)有關(guān)。PKC-β、PKC-δ、PKC-θ、PKC-ζ與細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)。PKC-ζ在SDF-1趨化人CD34+祖細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中起調(diào)節(jié)作用。在趨化因子趨化分葉核白細(xì)胞的粘附和肌動(dòng)蛋白聚合中也有PKC-ζ的參與。抑制PKC-ζ的活性會(huì)使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1表達(dá)降低,遷移運(yùn)動(dòng)能力減弱。目前,對(duì)于趨化因子SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合后,趨化表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的信號(hào)通路機(jī)制研究依舊不清楚。研究PKC-ζ是否會(huì)在SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用,它的活性會(huì)如何變化,是否影響SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞骨架變化,是本研究的研究重點(diǎn)。本研究主要目的、方法、結(jié)果和結(jié)論如下: 一、目的 初步探討在趨化因子SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合趨化表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中信號(hào)蛋白PKC-ζ的作用及其可能的機(jī)制,為進(jìn)一步研究趨化因子SDF-1趨化表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路,調(diào)控表皮干細(xì)胞遷移,促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供思路。 二、方法 1.從正常人包皮組織中消化分離得到表皮細(xì)胞,用人胎盤IV型膠原快速粘附法分選人表皮干細(xì)胞,在DK-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,免疫化學(xué)染色檢測(cè)表皮干細(xì)胞標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19。 2.Transwell實(shí)驗(yàn)分析不同PKC亞型抑制劑Staurosporine、Chelerythrine chloride和PS-ζ對(duì)SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的影響。 3.Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDF-1對(duì)人表皮干細(xì)胞作用后不同時(shí)間PKC-ζ磷酸化水平。 4.激光共聚焦成像觀察PKC-ζ抑制劑PS-ζ對(duì)SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞極化形態(tài)影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白熒光強(qiáng)度變化。 三、結(jié)果 1.對(duì)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,符合人表皮干細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。免疫化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)人表皮干細(xì)胞標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色的陽性表達(dá)。 2.趨化運(yùn)動(dòng)分析顯示,空白對(duì)照組的趨化指數(shù)0.89±0.11,陽性對(duì)照組的趨化指數(shù)11.39±0.38, 3個(gè)PKC亞型抑制劑Staurosporine、Chelerythrine chloride、PS-ζ處理組的趨化指數(shù)分別是9.88±0.26、0.67±0.11、1.44±0.17,其中PS-ζ處理組和陽性對(duì)照組之間差異顯著(P0.05),和空白對(duì)照組之間差異不顯著(P0.05)。 3.SDF-1對(duì)人表皮干細(xì)胞作用后不同時(shí)間PKC-ζ磷酸化水平,在沒有任何處理時(shí),即在0min時(shí),人表皮干細(xì)胞內(nèi)無明顯PKC-ζ活化(即PKC-ζ的磷酸化);而SDF-1作用表皮干細(xì)胞1min后,人表皮干細(xì)胞內(nèi)p-PKC-ζ表達(dá)水平升高。 4.用激光共聚焦顯微鏡對(duì)具有代表性的細(xì)胞極化形態(tài)現(xiàn)象照相,陽性對(duì)照組的細(xì)胞在SDF-1的作用下,相對(duì)于陰性對(duì)照組的細(xì)胞,呈現(xiàn)遷移運(yùn)動(dòng)狀,伸出片層狀偽足。而用PKC-ζ的特異性抑制物PS-ζ處理后的人表皮干細(xì)胞,同陰性對(duì)照組細(xì)胞相比較,細(xì)胞骨架變化不明顯,未見偽足伸出;用流式細(xì)胞儀對(duì)人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照組的細(xì)胞在SDF-1的作用后,細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度增高,均高于陰性對(duì)照組的細(xì)胞,而用PKC-ζ的特異性抑制物PS-ζ處理后的人表皮干細(xì)胞,即處理組細(xì)胞,在SDF-1的作用后,細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度并未出現(xiàn)同陽性對(duì)照組相似的增高情況,同陰性對(duì)照組細(xì)胞相比較,細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化不明顯。 四、結(jié)論 1.體外成功分離、培養(yǎng)出了人表皮干細(xì)胞。表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈棕黃色著色的陽性表達(dá)。說明體外分離培養(yǎng)出細(xì)胞符合人表皮干細(xì)胞鑒定特征。 2.特異性的抑制PKC-ζ使趨化因子SDF-1對(duì)人表皮干細(xì)胞的趨化活性顯著降低。 3.趨化因子SDF-1作用人表皮干細(xì)胞后p-PKC-ζ蛋白表達(dá)明顯增高。 4.特異性的抑制PKC-ζ能夠抑制趨化因子SDF-1對(duì)人表皮干細(xì)胞骨架影響,降低人表皮干細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1427072