本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌CFP10-PPE68融合蛋白表達(dá)及其在結(jié)核病診斷中的初步應(yīng)用　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌CFP10-PPE68融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中觀察CFP10-PPE68融合基因的表達(dá)，并用親和層析法分離純化重組蛋白；用純化的CFP10-PPE68重組蛋白作為診斷抗原，間接ELISA法檢測(cè)臨床診斷為肺結(jié)核病人和肺外結(jié)核病人血清標(biāo)本中相應(yīng)抗體，并判斷其特異性、敏感性和準(zhǔn)確性。為結(jié)核病的早期診斷提供新的思路。 方法： 1.以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，用PCR方法分別擴(kuò)增CFP10和PPE68基因，然后用基因拼接法擴(kuò)增CFP10-PPE68融合基因，，將其克隆至pET32a(+)載體中，構(gòu)建重組的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/CFP10-PPE68，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 2.將純化的CFP10-PPE68重組蛋白作為診斷抗原，間接ELISA法檢測(cè)臨床診斷為肺結(jié)核病人（251例）、肺外結(jié)核病人（66例）和健康體檢者（52例）共369例血清標(biāo)本中相應(yīng)抗體，并判斷其特異性、敏感性和準(zhǔn)確性。 結(jié)果： 1．重組的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/CFP10-PPE68雙向測(cè)序結(jié)果顯示與CFP10-PPE68基因編碼序列完全一致，表達(dá)產(chǎn)物可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約68000的蛋白條帶，為CFP10（相對(duì)分子質(zhì)量10900）、PPE68(相對(duì)分子質(zhì)量37330)與Trx-His(相對(duì)分子質(zhì)量20400)的融合蛋白條帶。 2.CFP10-PPE68重組蛋白作為診斷抗原，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，52例健康體檢者為陰性對(duì)照，檢測(cè)肺結(jié)核病人和肺外結(jié)核病人結(jié)核分枝桿菌感染的敏感性分別為98.4%，98.3%，特異性分別為27.6%，85.0%，準(zhǔn)確性分別為56.1%，91.5%。 結(jié)論： 1.成功的將結(jié)核分枝桿菌特異性基因CFP10、PPE68融合克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中，并在E.coli BL21中成功表達(dá)。 2.CFP10-PPE68蛋白作為診斷抗原，診斷結(jié)核分枝桿菌感染，特別是對(duì)難以診斷的肺外結(jié)核病診斷有一定參考價(jià)值。
[Abstract]:Objective:
The construction of Mycobacterium tuberculosis CFP10-PPE68 fusion gene prokaryotic expression plasmid, observe the expression of CFP10-PPE68 fusion gene in Escherichia coli BL21, and purification of recombinant protein by affinity chromatography; the purified CFP10-PPE68 recombinant protein as antigen, clinical diagnosis and detection of indirect ELISA method for the corresponding antibodies in patients with serum samples in patients with pulmonary tuberculosis and pulmonary tuberculosis. And determine its specificity, sensitivity and accuracy. Provide a new method for the early diagnosis of tuberculosis.
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本文編號(hào)：1424330