本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌DHBPs的結(jié)構(gòu)和功能研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的 核黃素(riboflavin)是輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前體物[1,2,3],對生物體的生物合成至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)許多革蘭陽性細(xì)菌(如肺炎鏈球菌,S.pneumoniae)、陰性細(xì)菌(如鼠傷寒沙門,Salmonella typhimurium)和真菌(白假絲酵母,Candida albicans)等如果不能夠從外界攝取足夠的黃素(flavin)就需要自身合成核黃素(vitamin B12,riboflavin)以維持菌體的生存與增殖[4,5,6]。 DHBPs (3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase),3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶,為核黃素生物合成關(guān)鍵酶之一[7]。在鎂離子存在的情況下DHBPs將5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate,Ru5P)分解為3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate,DHBP)和甲酸(formate)。生成的DHBP為核黃素合成的必需的原料之一[2]。因此如果能夠抑制DHBPs的活性,就可能阻斷細(xì)菌的核黃素的合成,進(jìn)而抑制細(xì)菌的生存和增殖。 人類沒有合成核黃素的相關(guān)的酶而直接從食物中獲得以維持生存需要。因此細(xì)菌參與生物合成核黃素的相關(guān)酶就成為抗菌藥物作用的靶位點(diǎn),其三維結(jié)構(gòu)的獲得將有為設(shè)計(jì)開發(fā)新一代抗菌藥物提供重要的結(jié)構(gòu)模型[7,8]。因此DHBPs可望成為新一代抗生素作用的靶蛋白質(zhì)。 針對世界肺炎鏈球菌的耐藥越來越嚴(yán)重的問題,開發(fā)創(chuàng)新型基于結(jié)構(gòu)的抗生素迫在眉睫。本課題通過對肺炎鏈球菌來源的DHBPs的結(jié)構(gòu)的解析,目的是為潛在的新型抗生素或者疫苗提供理論依據(jù)。 方法 克隆、表達(dá)、純化DHBPs蛋白質(zhì)并利用汽相擴(kuò)散法結(jié)晶獲得肺炎鏈球菌DHBPs的晶體,使用house X射線光源(轉(zhuǎn)靶)收集分辨率較好的衍射數(shù)據(jù);以Protein Data Bank(PDB)中以Candida albicans的DHBPs(PDB code 10.2210)的A鏈第1-200位氨基酸殘基作為模型,利用分子置換法(Molecular Replacement,MR)以獲得DHBPs晶體三維空間結(jié)構(gòu)模型。 結(jié)果 收到一套分辨率2.21-2.20?的數(shù)據(jù),用分子置換法解析出DJHBPs三維結(jié)構(gòu),并對其修正。修正后DHBPs的三維空間結(jié)構(gòu)(Rfactor =5.5 %,Rfree=34.5%,PDB code)。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn):DHBPs與已知的其它物種來源的DHBPs分子結(jié)構(gòu)相似,為進(jìn)化上結(jié)構(gòu)比較保守的蛋白質(zhì)。利用凝膠層析實(shí)驗(yàn)本研究證實(shí):DHBPs在溶液中為二聚體形式和單體兩種形式存在,與晶體中兩個(gè)單體結(jié)合成二聚體的分子堆積方式是相符合的;通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、序列分析發(fā)現(xiàn):底物作用位點(diǎn)位于DHBPs二聚體的結(jié)合位點(diǎn),多個(gè)氨基酸參與,包括:Arg 139、Thr143和His142等直接參與了與Ru5P的磷酸基團(tuán)的結(jié)合;Glu30、Asp32、Cys57、Glu163、Thr96(B分子)、His125(B分子)和Asp90(B分子)等直接參與了與Ru5P核酮糖基團(tuán)的結(jié)合,而Leu55和Phe85提供了酶與底物的結(jié)合疏水環(huán)境,為基于三維結(jié)構(gòu)的新型抗生素的研究提供理論依據(jù)。
[Abstract]:objective
Riboflavin (riboflavin) is a cofactor flavin adenine dinucleotide (flavin adenine dinucleotide FAD (Flavin) and flavin mononucleotide mononucleotide, FMN) the precursor of [1,2,3] biosynthesis is essential to organisms. The study found that many gram positive bacteria (such as Streptococcus pneumoniae, S.pneumoniae), negative bacteria (such as typhoid Salmonella, Salmonella and typhimurium) fungi (Candida albicans, Candida albicans), if not from the outside adequate intake of flavin (Flavin) requires the synthesis of riboflavin (vitamin B12, riboflavin) in order to maintain the survival and proliferation of [4,5,6]. cells
DHBPs (3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase), 3,4- -2- two hydroxy butanone -4- phosphate synthase, is one of the key enzymes in the biosynthesis of riboflavin [7]. magnesium ion in the presence of DHBPs 5- ribulose phosphate (ribulose-5-phosphate, Ru5P) - based -2- decomposition for 3,4- (3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate, DHBP -4- butanone phosphate) and benzoic acid (formate) generated by DHBP. As one of the necessary ingredients of riboflavin synthesis [2]. so to inhibit the activity of DHBPs, the synthesis may block the bacterial riboflavin, thereby inhibiting the survival and proliferation of bacteria.
No human enzyme involved in the synthesis of riboflavin and to maintain the survival needs directly from food. So the enzymes involved in the biosynthesis of riboflavin bacteria has become the target sites of antibacterial drug, its three-dimensional structure can be designed for the development of a new generation of antibacterial drugs provide important structural model [7,8]. so DHBPs is expected to become a new target protein a generation of antibiotics.
In view of the increasingly serious drug resistance of Streptococcus pneumoniae in the world, the development of innovative structure based antibiotics is imminent. The purpose of this study is to provide a theoretical basis for potential new antibiotics or vaccines by analyzing the structure of DHBPs from Streptococcus pneumoniae.
Method
Cloning, expression and purification of DHBPs protein and DHBPs of Streptococcus pneumoniae by vapor diffusion method using house crystal crystal X ray source (rotating target) better resolution of the diffraction data collection; with Protein Data Bank (PDB) in Candida albicans DHBPs (PDB code 10.2210) A chain 1-200 amino acid residues as a model, using the molecular replacement method (Molecular Replacement MR) to obtain DHBPs crystal three-dimensional space structure model.
Result
Received a set of resolution 2.21-2.20? Data, parse out the DJHBPs three-dimensional structure by molecular replacement method, and the correction. Three dimensional structure of modified DHBPs (Rfactor =5.5 Rfree=34.5%, PDB%, code). The structure analysis shows that the molecular structure of DHBPs and DHBPs from other species known as evolutionary structure similar. Comparison of conserved proteins by gel chromatography experiment. This study proved that DHBPs in solution for the existence of two polymer monomer and two types, and two single crystal with two molecular dimer packing is consistent; through the protein structure, sequence analysis showed: the substrate site located in DHBPs poly two binding sites of the amino acids involved, including: Arg 139, Thr143 and His142 were directly involved in the binding of phosphate groups of Ru5P; Glu30, Asp32, Cys57, Glu163, Thr96 (B), His125 (B) and Asp90 ( B molecules were directly involved in the binding of Ru5P to the nucleose group, while Leu55 and Phe85 provided the hydrophobic environment of enzyme and substrate, providing a theoretical basis for the research of new antibiotics based on three-dimensional structure.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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