本文關(guān)鍵詞：分泌型IgA嵌合抗體在中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞中的表達(dá)研究　出處：《陜西師范大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 禽流感病毒 嵌合SIgA抗體 CHO細(xì)胞 基因表達(dá)

【摘要】：分泌型ⅠgA(SIgA)是人體粘膜表面的主要抗體,是抵御病原體侵襲的第一道免疫防線。目前為止尚沒(méi)有人嘗試在動(dòng)物呼吸道或消化道使用分泌型IgA阻斷H5N1病毒的感染。由于禽流感主要是通過(guò)呼吸道或消化道感染,因此,呼吸道SIgA或消化道SIgA在病毒感染的最早期階段產(chǎn)生最有效的保護(hù)效果。本次研究選擇在中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢(chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞中表達(dá)嵌合SIgA抗體,此嵌和抗體是抗H5N1病毒的具有中和活性的抗體,并且嘗試了研究預(yù)防性分泌型IgA類(lèi)抗體。 從分泌抗禽流感的H5N1-HA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞HA8中提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上,進(jìn)行基因測(cè)序并且進(jìn)行基因序列的分析,經(jīng)過(guò)分析,此抗體為小鼠的免疫球蛋白基因,輕鏈可變區(qū)共有393個(gè)堿基, V段為IgKVⅢ家族,J段為IgKJ I家族,重鏈可變區(qū)共有414個(gè)堿基,其中,重鏈可變區(qū)屬于IgHVⅠ家族,J段來(lái)自IgHVⅡ家族,D段來(lái)自IgHVⅣ家族；通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù),將鼠源重鏈可變區(qū)基因與人的IGHA2基因進(jìn)行拼接,鼠的輕鏈可變區(qū)基因與人的CK進(jìn)行連接,成功構(gòu)建完成了人／鼠嵌合IgA抗體的基因。將人／鼠嵌合IgA抗體輕、重鏈基因分別克隆到表達(dá)載體pEF-dhfr-Neo載體中,此載體是以新霉素抗性基因(NEO)和二氫葉酸還原酶基因(DHFR)兩者為雙篩選標(biāo)記,以CMV早期啟動(dòng)子引導(dǎo)的。 用已經(jīng)成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pEF-IGK8和pEF-IGHA8轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞,經(jīng)過(guò)選擇性培養(yǎng)基(無(wú)次黃嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)進(jìn)行篩選,然后挑取陽(yáng)性克隆,利用MTX加壓的方法,進(jìn)一步加壓來(lái)提高表達(dá)量。然后對(duì)經(jīng)過(guò)加壓的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng),然后純化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗體,用親和層析柱(具有專(zhuān)一性結(jié)合人源抗體Kappa鏈的蛋白)從含有牛血清CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清中進(jìn)行純化嵌合IgA抗體,并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行了分析。最后,將構(gòu)建完成的表達(dá)質(zhì)粒pEF-IGHA8,pEF-IGK8瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)48-72小時(shí),細(xì)胞上清使用ELISA方法對(duì)SIgA抗體各組分的分泌情況進(jìn)行檢測(cè)。 總之,本研究成功且完整的克隆了抗H5N1病毒的中和性單抗可變區(qū)基因,并且對(duì)其可變區(qū)基因的序列進(jìn)行了胚系基因片段的分析；成功構(gòu)建了完整人-鼠嵌合IgA抗體的基因；成功的構(gòu)建了重組SIgA的相關(guān)的基因的表達(dá)載體；最后,通過(guò)對(duì)CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,初步得到了嵌合的IgA抗體和SIgA抗體。
[Abstract]:Secretory type 鈪，

本文編號(hào)：1411610