本文關(guān)鍵詞：宿主體內(nèi)幽門螺桿菌基因組多態(tài)性分析及形成機(jī)制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的: 幽門螺桿菌是一種革蘭陰性的螺旋桿菌,普遍存在于人類的胃黏膜。它在人類胃部長(zhǎng)期的定植可以導(dǎo)致不同的臨床疾病,如:慢性胃炎、胃潰瘍,甚至胃癌。其高效定植需要的先決條件在于幽門螺桿菌的高度進(jìn)化與適應(yīng)性。高度的遺傳多態(tài)性與高效的隨機(jī)重組是幽門螺桿菌兩大特征,這種特征表現(xiàn)為每個(gè)感染患者的幽門螺桿菌幾乎都有獨(dú)特的基因組大小、基因順序、遺傳信息以及等位基因譜。此外,同一株菌的不同變異體可能生存于同一宿主的胃內(nèi),互相作為一個(gè)潛在的基因型儲(chǔ)備,一旦宿主體內(nèi)出現(xiàn)新的選擇壓力,最具適應(yīng)性的基因型將在新平衡中成為優(yōu)勢(shì)菌群,保證了菌株的長(zhǎng)期定植。研究發(fā)現(xiàn),幽門螺桿菌的微進(jìn)化可能導(dǎo)致宿主體內(nèi)菌株的基因型發(fā)生變異以及胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化,不僅可能與耐藥和復(fù)發(fā)有關(guān),還可能影響胃上皮細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路,以此影響疾病的進(jìn)程。對(duì)宿主體內(nèi)感染菌株的基因多態(tài)性和變異性進(jìn)行研究分析,確定其變異規(guī)律和致病機(jī)制,也能有針對(duì)性地解決幽門螺桿菌感染治療中易出現(xiàn)的復(fù)發(fā)和耐藥難題。 目前,國(guó)外對(duì)幽門螺桿菌的基因多態(tài)性進(jìn)行了較為廣泛的研究,并運(yùn)用多種方法檢測(cè)單個(gè)宿主幽門螺桿菌的基因型多態(tài)性,但研究結(jié)果尤其是多態(tài)性百分比報(bào)道不一,由10%至67%不等。而國(guó)內(nèi)針對(duì)宿主體內(nèi)幽門螺桿菌基因多態(tài)性與致病性的研究還是空白。中國(guó)地區(qū)有著獨(dú)特的生活習(xí)慣和飲食文化,中國(guó)地區(qū)患者體內(nèi)的幽門螺桿菌基因多態(tài)性必將呈現(xiàn)其獨(dú)有的特征。 同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),一些臨床株的原代培養(yǎng)單菌落在傳代后不能生長(zhǎng),我們據(jù)此猜測(cè)傳代過(guò)程中可能會(huì)存在基因型的丟失。要真實(shí)地反映宿主體內(nèi)幽門螺桿菌基因組多態(tài)性,必須對(duì)過(guò)往研究方法進(jìn)行改良。因此,本實(shí)驗(yàn)以幽門螺桿菌原代單菌落為研究對(duì)象,通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)的方法檢測(cè)患者體內(nèi)幽門螺桿菌的基因組多態(tài)性。并通過(guò)患者體內(nèi)幽門螺桿菌原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)RAPD圖譜的比較,驗(yàn)證傳代過(guò)程中基因型丟失的假設(shè),進(jìn)一步證實(shí)宿主體內(nèi)基因組多態(tài)性的廣泛性。在明確宿主體內(nèi)幽門螺桿菌基因組多態(tài)性的基礎(chǔ)上,為了分析并初步探索這種多態(tài)性現(xiàn)象的形成機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)還將應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)的方法探尋這種宿主體內(nèi)的基因多態(tài)性現(xiàn)象的變異來(lái)源。 此外,作為一級(jí)致癌因子(grade I carcinogen),幽門螺桿菌在致癌過(guò)程中所起的重要作用一直非常受到關(guān)注。sabA基因作為幽門螺桿菌在定植過(guò)程中重要的黏附素,在長(zhǎng)期定植以及致癌過(guò)程中有可能發(fā)揮重要的作用。同時(shí),中國(guó)幽門螺桿菌的高感染率和高基因多態(tài)性百分比是否與地域和文化之間的差異有關(guān),仍有待研究。因此,本實(shí)驗(yàn)還將對(duì)毒力因子sabA基因進(jìn)行遺傳信息多態(tài)性的研究。 方法: 1.采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)2009-2010年間中國(guó)杭州和重慶的幽門螺桿菌臨床株,并從原代培養(yǎng)平皿上隨機(jī)挑取18-24個(gè)單菌落,提取單菌落基因組DNA,使用屬特異性的16S rDNA引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)對(duì)菌落進(jìn)行鑒別。選用三個(gè)隨機(jī)引物(1254, 1281和A11)來(lái)檢測(cè)原代菌落并建立原代RAPD圖譜。以各菌落的所有擴(kuò)增條帶完全相同為一種基因型,分別比較每個(gè)患者的基因型數(shù)目以確定其多態(tài)性。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株26695的傳代菌落作為對(duì)照,以鑒定RAPD系統(tǒng)的穩(wěn)定性。其中隨機(jī)選取20名患者的原代分離培養(yǎng)物持續(xù)培養(yǎng)3代后,挑取18-24個(gè)單菌落以同樣的方法進(jìn)行RAPD的檢測(cè),并對(duì)原代和傳代的RAPD圖譜進(jìn)行比較。同時(shí),用Fisher精確檢驗(yàn)法檢測(cè)基因型數(shù)目與臨床疾病之間的相關(guān)性。 2.為探尋同一患者不同基因型的變異來(lái)源,運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)的方法,分別對(duì)隨機(jī)選取的30名患者不同基因型的6個(gè)管家基因(atpA, efp, ppa, trpC, ureI and yphC)進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化后測(cè)序。序列比較由DNAssist 2.0軟件完成。通過(guò)各位點(diǎn)序列差異判斷其變異來(lái)源。 3.采用PCR及測(cè)序和比較基因組方法分析42株國(guó)內(nèi)癌癥及癌前病變患者的幽門螺桿菌sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)多態(tài)性。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件的Fisher’s精確檢驗(yàn)方法對(duì)陽(yáng)性率與疾病的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用MEGA 5.0聚類軟件的construct UPGMA tree功能聚類分析。 結(jié)果: 1.對(duì)116名患者體內(nèi)分離幽門螺桿菌的RAPD檢測(cè)結(jié)果顯示宿主體內(nèi)的基因多態(tài)性非常普遍。在最初用隨機(jī)引物1254檢測(cè)的結(jié)果中,宿主體內(nèi)幽門螺桿菌存在多種基因型的比例為83.6%。在使用3種隨機(jī)引物檢測(cè)后,基因多態(tài)性百分比達(dá)到99.1%,僅在一名胃炎患者中發(fā)現(xiàn)存在單一基因型。同一宿主內(nèi)有2-3種基因型在消化不良、胃炎、消化性潰瘍的患者占大多數(shù),其比例分別為100%、91.4%和77%。同一宿主內(nèi)有4種基因型主要出現(xiàn)在消化性潰瘍、萎縮性胃炎(癌前病變)和癌癥患者中,且比例相當(dāng),分別為20%、20%和17%。同一宿主內(nèi)有5種基因型只在消化性潰瘍、萎縮性胃炎(癌前病變)和癌癥患者中發(fā)現(xiàn),其比例分別為3%、20%和33%,呈梯度上升。臨床疾病分類與基因型數(shù)目之間有相關(guān)性(P0.05)。對(duì)其中20名患者的幽門螺桿菌傳代RAPD圖譜和原代圖譜的比較分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)體外傳代3次后90%患者(18/20)的幽門螺桿菌基因型減少到只有一種,另外2名患者的基因型減小為2種,大部分基因型由于無(wú)法適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境而丟失。 2.對(duì)30名患者不同基因型的菌落進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析結(jié)果表明,26名患者不同基因型菌落的6個(gè)管家基因序列是完全相同的。另外3名患者只有atpA位點(diǎn)DNA序列有部分無(wú)義點(diǎn)突變,氨基酸序列沒(méi)有影響。而另1名嚴(yán)重復(fù)合型潰瘍患者的其中一種基因型所擁有的yphC位點(diǎn)不僅DNA序列有13個(gè)堿基突變,也導(dǎo)致了氨基酸序列的4個(gè)氨基酸的改變,其中一個(gè)顛換(UAT變成UAG)導(dǎo)致了一個(gè)新的終止子產(chǎn)生,提前終止了翻譯過(guò)程。由于每名患者都至少有5個(gè)管家基因序列是完全相同的,可認(rèn)為宿主體內(nèi)的基因多態(tài)性來(lái)自同一菌株的變異。 3. sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的陽(yáng)性檢測(cè)率為85%,功能性sabA基因占所有測(cè)序菌株的55%。對(duì)隨機(jī)挑選的18株檢測(cè)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果顯示在堿基水平及蛋白質(zhì)水平存在顯著的遺傳多態(tài)性。對(duì)sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的氨基酸序列聚類分析中發(fā)現(xiàn),本研究的中國(guó)菌株與國(guó)際已經(jīng)完成測(cè)序的7株幽門螺桿菌可以明顯的分為兩個(gè)組,即中國(guó)組與西方組。 結(jié)論: 1.宿主體內(nèi)幽門螺桿菌基因組多態(tài)性現(xiàn)象在中國(guó)地區(qū)非常普遍;臨床疾病分類和患者體內(nèi)幽門螺桿菌RAPD基因型數(shù)目有相關(guān)性。原代培養(yǎng)物在傳代培養(yǎng)后基因型減少。 2.患者體內(nèi)的基因組多態(tài)性主要來(lái)源于同一菌株的變異。 3. sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)在中國(guó)菌株中普遍存在,且在翻譯水平有很顯著的多態(tài)性,含有功能性sabA基因的幽門螺桿菌菌株多態(tài)性存在明顯的地域性分布差異。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳超;洪愉;袁曉澎;鄒全明;;幽門螺桿菌尿素酶B基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分型和生物信息學(xué)分析[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2006年01期

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本文編號(hào)：1402198