本文關(guān)鍵詞：人類(lèi)心臟發(fā)育候選基因TRIM45及BZW2的蛋白相互作用研究及初步功能鑒定　出處：《湖南師范大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：心臟的發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜并且精細(xì)的過(guò)程。其主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由心源性轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)分化因子構(gòu)成,這些基因的突變或異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致早期胚胎死亡或者各種心臟疾病。其中,心肌肥厚是比較常見(jiàn)的一種心臟病。其發(fā)病機(jī)制一直是心臟疾病機(jī)理研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 TRIM家族基因在多種細(xì)胞功能方面起著重要的作用,包括細(xì)胞增殖,分化,發(fā)展,發(fā)生以及細(xì)胞凋亡。本研究室前期克隆了人類(lèi)TRIM45基因.基因全長(zhǎng)3584bp。Northern B lot分析結(jié)果顯示,TRIM45基因在成人的骨骼肌、腦、胰腺、心臟組織中依次有不同強(qiáng)度的表達(dá)。酵母雙雜交結(jié)果顯示TRIM45蛋白能夠與SLC25A3蛋白以及DNAJB6蛋白發(fā)生相互作用。本文利用免疫共沉淀技術(shù)證明了TRIM45蛋白在體內(nèi)能夠與SLC25A3蛋白以及DNAJB6蛋白發(fā)生相互作用。DNAJB6蛋白屬于熱休克蛋白家族(Hsp家族)。已有文獻(xiàn)表明,DNAJB6能夠通過(guò)與NFATc3相互作用來(lái)阻斷鈣調(diào)磷酸酶誘導(dǎo)的心肌肥厚,并且DNAJB6能夠抑制NFAT-Luc的熒光活性。本研究重復(fù)了DNAJB6對(duì)NFAT的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控研究,得到了與文獻(xiàn)一致的結(jié)果。為了更進(jìn)一步的了解TRIM45與心肌肥厚的關(guān)系,本研究利用熒光報(bào)告系統(tǒng)分別研究了TRIM45對(duì)心臟標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控。所用熒光報(bào)告質(zhì)粒包括NFAT-Luc、SRF-Luc和MEF2C-Luc。結(jié)果顯示,TRIM45能夠強(qiáng)烈抑制ANF-Lu、NFAT-Luc、SRF-Luc和MEF2C-Luc的熒光活性。另外,SLC25A3也能強(qiáng)烈抑制NFAT-Luc的熒光活性。這些結(jié)果一起表明TRIM45, SLC25A3, DNAJB6都是心肌肥厚抑制因子,并且可能通過(guò)形成復(fù)合物來(lái)共同抑制心肌肥大。 人類(lèi)BZW2基因是一個(gè)新基因,其功能未知。它由bzip結(jié)構(gòu)域和eIF5C結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。BZW2基因在人類(lèi),小鼠,大鼠,斑馬魚(yú),猩猩,狗,雞等物種中均存在同源基因。BZW2基因定位于人類(lèi)染色體7p21.1,在小鼠中定位于12；12B2。人類(lèi)BZW2蛋白與小鼠BZW2蛋白同源度非常高,達(dá)到了99%。人類(lèi)BZW2基因全長(zhǎng)1883bp,編碼419個(gè)氨基酸。本文用PCR技術(shù)擴(kuò)增了人類(lèi)BZW2基因的全長(zhǎng),將目的片段插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中,經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,純化后免疫新西蘭大白兔。BZW2多克隆抗體效價(jià)為1：50。利用小鼠組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析,結(jié)果顯示BZW2在小鼠心臟,肌肉以及腦組織中高表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BZW2蛋白能夠與BZW1、PSTPIP1蛋白發(fā)生物理相互作用。通過(guò)熒光報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),BZW2能夠抑制NF-kB和NFAT的轉(zhuǎn)錄活性,提示BZW2可能是一個(gè)潛在的心臟發(fā)育候選基因。
[Abstract]:Cardiac development is an extremely complex and delicate process. Its main regulatory network is composed of cardiogenic transcription factors and growth and differentiation factors. Mutations or abnormal expression of these genes can lead to early embryonic death or various heart diseases. Myocardial hypertrophy is a common heart disease, and its pathogenesis has been a hot spot in the field of heart disease. TRIM family genes play an important role in many cell functions, including cell proliferation, differentiation and development. The human TRIM45 gene was cloned in the early stage of this study. The full-length of the gene was 3584 bp.Northern B lot analysis. The TRIM45 gene is present in adult skeletal muscle, brain, and pancreas. The results of yeast two-hybrid showed that TRIM45 protein could interact with SLC25A3 protein and DNAJB6 protein. The results show that TRIM45 protein can interact with SLC25A3 protein and DNAJB6 protein in vivo. DNA JB6 protein belongs to heat shock protein family. Hsp family. DNAJB6 can block the cardiac hypertrophy induced by calmodulase by interacting with NFATc3. Moreover, DNAJB6 can inhibit the fluorescence activity of NFAT-Luc. In this study, the regulation of NFAT transcriptional activity by DNAJB6 was repeated. In order to further understand the relationship between TRIM45 and myocardial hypertrophy. In this study, we studied the transcriptional activity of TRIM45 on cardiac marker genes by fluorescence reporting system. The fluorescent reporter plasmids including NFAT-Luc were used. The results of SRF-Luc and MEF2C-Luc. showed that TRIM45 could strongly inhibit ANF-Lun NFAT-Luc. The fluorescence activity of SRF-Luc and MEF2C-Luc. In addition, SLC25A3 also strongly inhibited the fluorescence activity of NFAT-Luc. These results indicated that TRIM45. SLC25A3, DNAJB6 are myocardial hypertrophy suppressor, and may inhibit myocardial hypertrophy by forming complex. Human BZW2 gene is a new gene whose function is unknown. It consists of bzip domain and eIF5C domain. BZW2 gene is composed of human, mouse, rat, zebrafish, gorilla, dog. The homologous gene. BZW2 was located in human chromosome 7p21. 1 and in mice. 12B2.The homology between human BZW2 protein and mouse BZW2 protein is very high, reaching 99%. The length of human BZW2 gene is 1883 BP. The full length of human BZW2 gene was amplified by PCR. The target fragment was inserted into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 and identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transferred into BL21 receptive cells and the fusion protein was induced by IPTG. The polyclonal antibody titer of purified New Zealand white rabbit. BZW2 polyclonal antibody was 1: 50. Western blot analysis was carried out in mouse tissues. The results showed that BZW2 was in the heart of mice. It was found that BZW2 protein could interact with BZW1PSTPIP1 protein by bioinformatics analysis, and it was found by fluorescence report system analysis that BZW1PSTPIP1 protein could interact with BZW1PSTPIP1 protein. BZW2 can inhibit the transcriptional activity of NF-kB and NFAT, suggesting that BZW2 may be a potential candidate gene for cardiac development.
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R394

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本文編號(hào)：1401662