本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲腸期抗原基因的沙門氏菌運(yùn)載體研究　出處：《吉林大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：旋毛蟲病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病，給我國(guó)的畜牧生產(chǎn)和食品安全造成持續(xù)性危害。旋毛蟲感染宿主主要有兩個(gè)特點(diǎn)：調(diào)節(jié)宿主機(jī)體發(fā)生免疫抑制和誘導(dǎo)宿主肌細(xì)胞分化為保姆細(xì)胞。以往的研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲排泄分泌抗原ES（Excreat/Secreatproduct）在這兩個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于旋毛蟲ES成分復(fù)雜且難于收集，對(duì)其中特定抗原成分進(jìn)行純化較為困難；而原核表達(dá)抗原蛋白又存在缺乏修飾及喪失活性等問(wèn)題，因此從分子水平研究ES在旋毛蟲與宿主互作過(guò)程中的功能還存在著很大局限。沙門氏菌是一種能感染人和動(dòng)物的致病性細(xì)菌，由于其遺傳背景清晰，易于減毒和操作，目前許多研究將減毒沙門氏菌作為基因運(yùn)載體用于疫苗的研究和抗腫瘤基因免疫研究。攜帶外源真核質(zhì)粒的沙門氏菌經(jīng)過(guò)口服到達(dá)腸道后，被腸道淋巴組織的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presentation Cell，APC)捕獲、裂解后釋放出真核質(zhì)粒，質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄并表達(dá)目的基因。由于抗原遞呈細(xì)胞具有游走性，目的基因除了在腸道相關(guān)淋巴組織中表達(dá)，還可由抗原遞呈細(xì)胞運(yùn)送至全身各處淋巴組織中表達(dá)，因此理論上減毒沙門氏菌載體也可作為研究某種特定基因功能的有效工具。本實(shí)驗(yàn)首次以研究基因功能為目的利用減毒沙門氏菌將旋毛蟲抗原基因攜帶到宿主體內(nèi)，并觀察目的基因?qū)λ拗髅庖呦到y(tǒng)的影響。 T626-55和T668是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)旋毛蟲不同時(shí)期cDNA進(jìn)行免疫篩選和抑制性差減雜交文庫(kù)（Suppression Subtractive Hybridization）篩選得到的兩種重要的旋毛蟲抗原基因，分別編碼旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑和新生幼蟲時(shí)期絲氨酸蛋白酶。兩者可能在旋毛蟲與宿主互作方面發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)RT-PCR從肌幼蟲和新生幼蟲cDNA中調(diào)取目的基因，并連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒T626-55-pcDNA3.1和T668-pcDNA3.1。將重組質(zhì)粒分別通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小鼠BHK細(xì)胞系，免疫熒光分析顯示重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中成功得到了表達(dá)。然后分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌PhoP/PhoQ（PQ）株，獲得攜帶這兩個(gè)基因的重組菌株T626-55-PQ和T668-PQ。兩者通過(guò)口服感染小鼠后，利用RT-PCR和組織間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)目的基因在脾臟中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。結(jié)果顯示外源基因在體內(nèi)成功地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 為了研究表達(dá)這兩種外源基因?qū)λ拗髅庖呦到y(tǒng)的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)感染T626-55-PQ和T668-PQ后引起宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫變化進(jìn)行了初步檢測(cè)，并同時(shí)評(píng)價(jià)了其對(duì)宿主感染旋毛蟲后收集蟲體數(shù)量的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示兩種重組菌均可誘導(dǎo)宿主的細(xì)胞免疫反應(yīng)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T626-55-PQ可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgG和腸道分泌特異性IgA；而T668-PQ感染后卻不誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的IgG和IgA抗體。利用Real-Time PCR對(duì)脾細(xì)胞T-bet因子和GATA-3因子的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，顯示感染T626-55-PQ和T668-PQ后T-bet因子皆無(wú)明顯變化而GATA-3因子明顯升高，兩種蛋白都調(diào)節(jié)宿主免疫向Th2方向偏移。感染T626-55-PQ和T668-PQ后對(duì)宿主荷蟲數(shù)量變化效果通過(guò)成蟲回收率、雌蟲生殖率和肌幼蟲回收率三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示T626-55導(dǎo)致旋毛蟲雌蟲生殖率明顯降低，新生幼蟲蟲體體積減�。籘668導(dǎo)致成蟲回收率降低，，而肌幼蟲回收率升高。 綜上所述，本研究利用減毒沙門氏菌PQ株為載體成功地使旋毛蟲T626-55和T668抗原基因在小鼠體內(nèi)得到了表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞免疫、體液免疫、轉(zhuǎn)錄因子及蟲體數(shù)量的評(píng)估推測(cè)這兩個(gè)基因的功能。結(jié)果顯示，T626-55基因可能與旋毛蟲的發(fā)育和性成熟有關(guān)；T668基因參與免疫排蟲的啟動(dòng)和旋毛蟲對(duì)宿主的免疫抑制。本研究證實(shí)利用減毒沙門氏菌為載體對(duì)病原體抗原功能進(jìn)行研究這一途徑是切實(shí)可行的。
[Abstract]:Trichinosis is a kind of pathogenic bacterium which can infect humans and animals . It has two characteristics : regulating host organism ' s immune suppression and inducing host muscle cell to differentiate into cells . The recombinant plasmids T626 - 55 - pcDNA3.1 and T668 - pcDNA3.1 were successfully constructed by RT - PCR . The recombinant plasmids T626 - 55 - pcDNA3.1 and T668 - pcDNA3.1 were successfully constructed by RT - PCR . In order to study the effects of these two exogenous genes on host immune system , the effects of T626 - 55 - PQ and T668 - PQ on the humoral immunity and cellular immune changes of host were investigated . The results showed that T626 - 55 - PQ induced specific IgA in the host . The results showed that T626 - 55 - PQ and T668 - PQ could induce specific IgG and IgA antibody . In conclusion , the results showed that T626 - 55 gene might be related to the development and sexual maturation of trichina . The results showed that T626 - 55 gene might be related to the development and sexual maturation of trichina .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R383

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本文編號(hào)：1396238